Файл: Изучение влияния цитокинов на функции эндотелиальных клеток человека перевиваемой линии EA.Hy926.zip
Добавлен: 15.04.2026
Просмотров: 62
Скачиваний: 0
Введение
Актуальность проблемы. Ангиогенез представляет собой многоступенчатый процесс, который включает взаимодействие нескольких типов клеток и медиаторов в соответствующем микроокружении, благоприятном для формирования новых сосудов из предсуществующих. Ангиогенез очень редко происходит при физиологических условиях (циклические процессы в репродуктивной системе, ранозаживление, обновление волосяного покрова), но может вносить существенный вклад в патогенез ряда патологических процессов (канцерогенез, гемобластозы, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, неспецифический язвенный колит, диабетическая ретинопатия). Клетки - участники воспалительного процесса (Т-лимфоциты, моноциты/макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы) участвуют в регуляции ангиогенеза за счет продукции про- и противовоспалительных цитокинов, ростовых факторов, которые влияют на функции эндотелиальных клеток (ЭК): их пролиферацию, миграцию и дифференцировку. В связи с тесной сопряженностью процессов воспаления и ангиогенеза весьма актуальным является изучение характера влияния цитокинов на свойства ЭК и на ангиогенез в целом.
В литературе отражены результаты отдельных исследований, свидетельствующие о возможности стимулирующих и ингибирующих эффектов цитокинов в отношении ангиогенеза. Однако результаты этих исследований чрезвычайно вариабельны. Это связано с многообразием используемых экспериментальных систем и с гетерогенностью ЭК. В частности, данные, полученные с использованием микрососудистого эндотелия, отличаются от наблюдений, сделанных на клетках макрососудов. Результаты, полученные на первичных культурах ЭК, отличаются от результатов, полученных на перевиваемых культурах. Эффекты разных цитокинов изучались в разных экспериментальных системах и полученные результаты не сопоставимы.
Цель работы. Провести изучение влияния ростовых факторов и цитокинов на функции ЭК человека с использованием в качестве экспериментальной модели перевиваемой линии клеток EA.Hy926.
Задачи исследования.
1. разработать оптимальные методы оценки пролиферативной, миграционной, адгезионной активности ЭК человека линии EA.Hy926, экспрессии ими интегринового комплекса бнв3 и продукции матриксной металлопротеиназы-9;
2. разработать метод количественной оценки способности ЭК человека линии EA.Hy926 формировать капилляроподобные структуры;
3. изучить влияние ростовых факторов и цитокинов на функции ЭК с использованием разработанной экспериментальной модели.
Научная новизна работы. В ходе работы была разработана новая экспериментальная модель, которая позволяет проводить изучение влияния биологически активных веществ на важнейшие функции ЭК человека линии EA.Hy926. Впервые проведено сопоставление влияния основных ростовых факторов и разных цитокинов на свойства ЭК, причастные к ангиогенезу, в рамках одной экспериментальной модели. С использованием такого подхода впервые было показано, что IL-8 может играть роль более мощного индуктора пролиферативного ответа ЭК, чем ангиогенные ростовые факторы VEGF и bFGF. Результаты работы позволили выявить новое свойства ростовых факторов VEGF и bFGF - усиливать адгезию ЭК. Впервые выявлены противоречивые характеристики IFNг и GM-CSF, которые способны избирательно повышать сродство ЭК к коллагену I типа при отсутствии влияния на другие свойства ЭК. Также впервые была показана экспрессия интегринового комплекса бнв3 на поверхности ЭК человека линии EA.Hy926.
В ходе работы были разработаны новые модификации методов оценки пролиферативной активности ЭК с использованием витального внутриклеточного флуоресцентного красителя белка CFSE и количественной оценки способности ЭК линии EA.Hy926 формировать капилляроподобные структуры на Матригеле.
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований были получены новые данные о влиянии конкретных цитокинов на функции ЭК, причастные к ангиогенезу. Показано, что провоспалительные цитокины в основном обладают проангиогенной активностью, что вносит дополнительный вклад в понимание их патогенетической роли при патологических состояниях, ассоциированных с усиленным ангиогенезом. IFNб в той же экспериментальной системе проявил ингибирующую активность в отношении пролиферации и миграции ЭК - ключевых событий ангиогенеза, что дополнительно обосновывает его использование в комбинированной противоопухолевой терапии.
Разработанная экспериментальная модель может быть в дальнейшем использована для оценки влияния на свойства ЭК, актуальные для ангиогенеза, различных биологически активных веществ и фармакологических агентов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Разработанная экспериментальная модель позволяет проводить комплексное изучение про- и антиангиогенных эффектов биологически активных веществ;
2. Ростовые факторы VEGF, bFGF и провоспалительные цитокины TNFб, IL-1в, IL-8 оказывают однонаправленное стимулирующее действие на свойства ЭК человека линии EA.Hy926, актуальные для ангиогенеза;
3. IFNб зарекомендовал себя как ингибитор ангиогенного потенциала ЭК человека линии EA.Hy926.
Реализация работы. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них - 3 статьи.
Личный вклад в проведение исследования. Личным вкладом автора в выполненную работу является самостоятельное проведение всех описанных исследований и интерпретация полученных результатов. Вклад соавторов по публикациям ограничивался предоставлением в распоряжение автора ряда биологически активных пептидов, технической помощью в проведении анализа образцов на проточном цитофлуориметре, помощью при получении коллагена I типа.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на научной конференции с международным участием “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге” (Санкт-Петербург, 2002, 2003, 2004, 2005 и 2006 г.г.), на 6ой и 7ой международной школе иммунологов им. Дж. Хамфри (Пущино, 2003 и 2005г.г.), на 12ом международном конгрессе по иммунологии “Clinical and Investigative Medicine” (Канада, 2004), на 18ом Американском симпозиуме по пептидам (США, 2004).
1. Материалы и методы
ангиогенез клетка эндотелиальный
Работа проводилась с использованием ЭК человека линии EA.Hy926, которая была любезно предоставлена Dr. C. J. Edgel (Университет Северной Каролины, США). Культура была получена путем гибридизации первичной линии ЭК HUVEC с линией клеток аденокарциномы легкого A-549. Клетки линии EA.Hy926 воспроизводят основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики, присущие ЭК макрососудов. Использовали следующие условия культивирования: среда DMEM (Sigma, США); 10% от общего объема среды инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (ICN, США), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (АО Самсон, Санкт-Петербург), 2 ммоль L-глютамина (ICN, США) и HAT (ICN, США). Культивировали клетки при 37оС во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2. Пересев осуществляли 1 раз в 3-4 дня по общепринятой методике, вызывая дезинтеграцию монослоя 5-10-минутной экспозицией в растворе Версена (Биолот, Санкт-Петербург). В работе использовали пластиковые флаконы (Costar, США и Sarstedt, Австрия) и плоскодонные планшеты для культивирования клеток (Greiner, Германия; Costar, США и Sarstedt, Австрия). Отсутствие инфицированности (в том числе, микоплазмой) контролировалось.
В работе использовались рекомбинантные препараты человеческих цитокинов и ростовых факторов: bFGF - (Becton Dickinson, США), VEGF - (BioSource, США), GM-CSF - “Leucomax” (Schering-Plough) (специфическая активность препарата 1ЕД = 1 нг), TNFб - “Рефнолин” (специфическая активность препарата 1ЕД = 0,06 нг), IL-1в “Беталейкин” (специфическая активность препарата 1ЕД = 0,01 нг) (НИИ Особочистых биопрепаратов, Санкт-Петербург), IL-8 - (CytoLab/PeproTech, Израиль), IFNб - “Реаферон”, IFNг - “Гаммаферон” (НПО “Фермент”, “Sanitas”, Литва), IL-4 - (Becton Dickinson, США) (специфическая активность препарата 1ЕД = 0,2 нг). Синтетические тканеспецифические пептиды из группы геморфинов были любезно предоставлены с.н.с. Е.Ю.Блищенко и проф. А.А.Михайловой (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва).
Чувствительность ЭК человека линии EA.Hy926 к цитотоксическому действию различных биологически активных факторов оценивали в стандартном МТТ-тесте, определяя оптическую плотность (ОП) с помощью автоматического спектрофотометра (SLT-Spectra, Австрия) при длине волны 540 нм. Интенсивность цитотоксического действия выражали в единицах ОП. По степени снижения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о цитотоксическом действии препаратов.
Оценка пролиферативной активности ЭК человека линии EA.Hy926 с помощью окраски кристалл-виолетом проводили по общепринятой методике. Результаты оценивали, определяя ОП с помощью автоматического спектрофотометра (SLT-Spectra, Австрия) при длине волны 540 нм. Интенсивность пролиферации клеток выражали в единицах ОП. По степени изменения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о влиянии препаратов на интенсивность пролиферации.
Дополнительно для оценки пролиферативной активности ЭК человека линии EA.Hy926 был разработан метод с использованием витального внутриклеточного флуоресцентного красителя белка - CFSE. Клетки отмывали средой DMEM и окрашивали CFSE (Sigma, США) в концентрации 5 мкмоль в среде DMEM. Окрашенные красителем клетки культивировали в 48 луночных планшетах (15000 клеток в мл) 72 ч в среде без добавления ЭТС. По окончании инкубации дезинтеграцию монослоя вызывали 10-минутной экспозицией в растворе Версена, после чего проводили учет интенсивности флуоресценции с использованием проточной цитофлюориметрии (FACStrack, Becton Dickinson). Цитометрический анализ проводили на основе определения трех параметров: малого углового светорассеяния (FSC), бокового светорассеяния (SSC) и показателя зеленой флюоресценции CFSE (FL-1). Для обработки данных проводили гейтинг исследуемых клеток в координатах FSC (ось абсцисс) и SSC (ось ординат). Затем данную группу анализировали на наличие флюоресценции в координатах FL1 зеленое свечение (CFSE). Для оценки активности пролиферации клеток, необходимо было выделить пики (маркеры) интенсивности свечения, соответствующие распределению красителя в делящихся клетках. По степени изменения интенсивности флуоресценции клеток, культивировавшихся в присутствие исследуемых препаратов, по сравнению с контрольными, судили о влиянии препаратов на интенсивность пролиферации.
Кроме того, пролиферативную активность ЭК линии EA.Hy926 оценивали по интенсивности включения бромдезоксиуридина в ДНК делящихся клеток. Эксперименты проводили в соответствие с протоколом фирмы-производителя (Amersham Biosciences, Великобритания). Результаты оценивали, определяя ОП с помощью автоматического спектрофотометра (SLT-Spectra, Австрия) при длине волны 490 нм. Интенсивность пролиферации клеток выражали в единицах ОП. По степени изменения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о влиянии препаратов на интенсивность пролиферации.
Для получения коллагена I типа использовали вариант общепринятого метода, разработанный в лаборатории проф. И.Г. Козлова (ММА им. И.М. Сеченова). Стерилизацию полученного раствора коллагена с соблюдением всех правил стерильности проводили при помощи центрифугирования (40000 об/мин и 4оС 1 час). Полученный стерильный надосадок хранили при -20оС. Концентрацию полученного раствора коллагена оценивали на основании определения концентрации оксипролина, составляющего до 80% коллагена I типа.
Оценку миграции ЭК линии EA.Hy926 проводили с помощью модифицированного метода компании Becton Dickinson “BD BioCoat™ Angiogenesis System - Endothelial Cell Migration”. Использовали поликарбонатные трансвеллы (фильтры) 24-х луночного формата (Becton Dickinson) с диаметром пор 3 мкм, предварительно обработанные раствором коллагена I типа (100 мкг/мл). Клетки помещали в верхние камеры (250 мкл клеточной суспензии с концентрацией 200000 клеток/мл), а исследуемые и контрольные растворы - в нижние, в 750 мкл среды, содержащей 0,5% ЭТС. При этом обе камеры оказываются разделенными полупроницаемым фильтром, обработанным раствором коллагена I типа. После этого клетки инкубировали 20 ч при 37оС и 5% СО2. По окончанию срока инкубации извлекали фильтры, остатки среды отбирали дозатором и аккуратно удаляли ватным тампоном клетки с поверхности фильтра, обращенной в верхнюю камеру, чтобы избежать окраски немигрировавших клеток. После этого фильтры с клетками на нижней стороне фиксировали 30 минут в метаноле при 4оС, далее высушивали, и клетки окрашивали по Романовскому-Гимзе. Результаты оценивали по среднему значению количества мигрировавших клеток, которое подсчитывали при микроскопии по результатам 5 рандомизированных полей зрения в трех независимых экспериментах, при увеличении микроскопа Ч120. Активность миграции выражали средним количеством мигрировавших клеток. О влиянии препаратов судили по изменению среднего количества мигрировавших клеток в лунках с препаратами по сравнению с количеством клеток при спонтанной миграции.
Оценку образования ЭК линии EA.Hy926 капилляроподобных структур проводили с использованием Матригеля (продукт опухолевой линии клеток Engelberth-Holm-Swarm, представляющий собой композит из различных видов белков внеклеточного матрикса: ламинина, коллагена IV типа, энтактина и гепарансульфат протеогликанов) (Becton Dickinson, Великобритания). Нами разработана модификация данного метода, которая позволяет снизить расход Матригеля в 4 раза, сохраняя возможность количественного учета результатов. Сущность модификации заключается в использовании коллагеновой подложки. Для этого 400 мкл раствора коллагена I типа в концентрации 1 мг/мл, полученного из сухожильных тяжей хвостов лабораторных крыс, вносили в лунки 24-луночного планшета и 1-2 ч инкубировали при 37°С и 5% СО2 до полной полимеризации. Затем во все лунки планшета, содержащего коллаген, вносили неразведенный Матригель. Для этого весь расходный материал (наконечники для дозаторов, планшеты и пробирки для разведения Матригеля) предварительно охлаждали, для предотвращения преждевременной полимеризации матрикса. Матригель размораживали на льду, ресуспендировали, избегая образования пузырей, и вносили в объеме 100 мкл поверх коллагена. Далее планшет инкубировали в течение 30-60 мин при 37°С и 5% СО2 до образования геля. После полимеризации матрикса аккуратно вносили клетки (200000 кл.) в 500 мкл среды и исследуемые препараты в 10 мкл среды, содержащей 2% ЭТС. Через 24 часа проводили количественный учет результатов. За вышеуказанное время клетки на границе раздела двух видов матрикса формировали сеть из капилляроподобных структур. Документацию результатов проводили с помощью фотографирования цифровым фотоаппаратом Nikon Coolpix 4500 (Nikon, Япония) с окулярным адаптером к инвертированному микроскопу Биолам-П1 (ЛОМО, Санкт-Петербург). При этом суммарное увеличение составляло Ч120. Последующий анализ полученных фотографий проводили с использованием программы “ImagJ” (данная программа в свободном доступе размещена на веб-сайте National Institute of Health http://rsb.info.nih.gov/nih-image/download.html). При анализе полученных изображений мы расценивали клеточный тяж между двумя клеточными агрегатами как капилляроподобную структуру и учитывали среднюю длину этих капилляроподобных структур, которую выражали в пикселях, (Рис. 1). Результаты оценивали по средним значениям вышеназванных показателей, которые подсчитывали по результатам 5 рандомизированных полей зрения в трех независимых экспериментах (Рис. 1). О влиянии препаратов на способность ЭК человека линии EA.Hy926 к образованию капилляроподобных структур судили по изменению средней длины одной капилляроподобной структуры в лунках с препаратом по сравнению с контрольными.