Файл: Исследование меристематическиих клеток корешков проростков Allium cepa L.rtf
Добавлен: 01.07.2026
Просмотров: 8
Скачиваний: 0
Исследование меристематическиих клеток корешков проростков Allium cepa L
Реферат
Дипломная работа
Ключевые слова: водный экстракт куколок китайского дубового шелкопряда, митотическое деление, Allium-тест, патология митоза
Объект исследования: меристематические клетки корешков проростков Allium cepa L.
Предмет исследования: действие гидрофильных компонентов куколок китайского дубового шелкопряда на цитогенетические и морфометрические параметры тест-объекта Allium cepa L. в норме и при стрессе.
Цель работы: изучить влияние различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на цитогенетические и морфометрические параметры в клетках корневых меристем Allium cepa L. в норме и после радиоактивного облучения.
Результаты исследования: Установлено, что наиболее оптимальными концентрациями ВЭКШ, действующими на исследуемые цитогенетические параметры, являются 0,001 и особенно 0,0001 мл исходного ВЭКШ в 100 мл воды. Минимальная исследуемая концентрация ВЭКШ была наиболее близка к физиологическим условиям по параметрам: длительность фаз митоза, патология митоза, спектр патологий митоза.
Также установлено, что тестируемое хроническое радиоактивное облучение луковиц способствует повышению показателя «патология митоза без учета профаз».
Использование ВЭКШ снижало обсуждаемый показатель в 1,5-5,0
раз. Несомненна эффективная концентрация ВЭКШ опытного варианта I-о6.
Содержание
Введение
. Обзор литературы
.1 Использование антиоксидантов и их влияние на геном клеток
.2 Растительная тест-система Allium cepa
.3 Митотическое деление клеток
.4 Патология митоза
.5 Нарушение митотической активности клеток
.6 Способы облучения растений
. Объект, программа и методика исследований
.1 Объект и программа исследований
.2 Методика исследований
. Результаты исследований и их обсуждение
.1 Цитогенетические и морфометрические параметры A.cepa L. в норме
.1.1 Морфологические параметры Allium cepa L
.1.2 Продолжительность фаз митоза в корневой системе Allium cepa L
.1.3 Патология митоза
.1.4 Уровень и спектр патологий митоза
.2 Цитогенетические и морфометрические параметры A.cepа L. после радиоактивного облучения
.2.1 Морфологические параметры Allium cepa L
.2.2 Митотический индекс
3.2.3 Продолжительность фаз митоза в корневой системе Allium cepa L
3.2.4 Патология митоза
Заключение
Список
использованных источников
Введение
Среди источников биологически активных веществ, используемых в растениеводстве, до настоящего времени не применяли препараты из гемолимфы куколок китайского дубового шелкопряда, хотя по химическому составу гемолимфа может быть использована для получения высокоэффективных стимуляторов роста. Ранее было обнаружено ингибирующее действие водного экстракта куколок шелкопряда (ВЭКШ) на образование in vivo активных форм кислорода и галогенов в нейтрофилах, что свидетельствует об его антиоксидантном действии [1]. Выявлен состав гемолимфы и водного экстракта куколок шелкопряда, содержащий комплекс аминокислот, углеводов, микроэлементов и антиоксидантов, который оптимален для функционирования эукариотических клеток. Установлено общее количество свободных аминокислот в жидком содержимом куколок дубового шелкопряда, которое составляет 14-16 г/л; в том числе обнаружены следующие незаменимые аминокислоты (М±m, ммоль/л): треонин (10,28±0,272), гистидин (10,26±0,367), лизин (8,66±0,586), валин (8,16±0,193), лейцин (4,76±0,133), изолейцин (4,34±0,145), фенилаланин (1,04±0,070), метионин (0,67±0,083) [1].
Однако следует принять во внимание, что антиоксиданты, в зависимости от концентрации и других факторов, могут проявлять либо антиоксидантное действие, либо прооксидантное, либо вообще не проявлять какого-либо эффекта на интенсивность накопления активных форм кислорода и скорость реакций свободнорадикального окисления, и тем самым на общее состояние организма и его адаптивность.
Цель работы: изучить влияние различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на цитогенетические и морфометрические параметры в клетках корневых меристем Allium cepa L. в норме и после радиоактивного облучения.
Актуальность работы: всестороннее изучение влияния водного
экстракта куколок китайского дубового шелкопряда имеет огромное значение при
выявлении морфометрических и цитогенетических параметров различных растений,
так как в составе гемолимфы и водного экстракта куколок шелкопряда содержится
комплекс аминокислот, углеводов, микроэлементов и антиоксидантов, который
оптимален для функционирования эукариотических клеток, как в оптимальных
условиях, так и при стрессе.
1. Обзор литературы
.1 Использование антиоксидантов и их влияние на геном клеток
растений
Выявлено, что значительное негативное влияние на биохимические процессы в организмах высших организмов оказывают особые химические частицы, называемые "свободными радикалами". Свободные радикалы представляют собой чрезвычайно активные образования (молекулы, а точнее частицы, имеющие неспаренные электроны), образующиеся в процессе жизнедеятельности организма, а также при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды (радиация, загрязненная атмосфера, химические соединения и т.п.). Такие молекулы стремятся отнять электрон у других "полноценных" молекул, вследствие чего "пострадавшая" молекула сама становится свободным радикалом развивается разрушительная цепная реакция, губительно действующая на живую клетку. Негативное действие свободных радикалов проявляется в ускорении старения организма, в ослаблении иммунной системы и других защитных функций. Эти нарушения связаны, прежде всего, с повреждением клеточных мембран. Свободные радикалы могут также проявлять мутагенные свойства, связанные с нарушением структуры молекул ДНК и рибосомной РНК, вызывая изменения наследственной информации и ослабляя жизненные силы организма. В процессе эволюции клетки живых организмов выработали многочисленные свойства и функции, которые помогают им выживать в естественных условиях. И одним из таких широко распространенных природных соединения являются антиоксиданты, которые часто вырабатывают самими организмами. Спектр биологического действия антиоксидантов весьма разнообразен и обусловлен в основном их защитными функциями, выраженными в способности нейтрализовать негативное действие свободных радикалов. К числу наиболее известных антиоксидантов относятся токоферолы, каротиноиды, аскорбиновая кислота. Мощным антиоксидантным действием обладают также природные соединения растительного происхождения, объединенные под общим название - флавоноиды [2-7].
Однако огромный поток неблагоприятных внешних факторов различного происхождения приводит к ситуации, когда защитные механизмы самого организма на разных уровнях структуризации уже не в состоянии нейтрализовать образование агрессивных частиц, нарушающих скорость свободнорадикального окисления липидов мембран клеток, что в конечном итоге приводит к повреждению нуклеиновых кислот и/или хромосом. Поэтому важной и актуально задачей является активный поиск соединений, обладающих антиоксидантными, антимутагенными и иными полезными свойствами.
Новые антиоксиданты должны характеризоваться максимально широким действием на свободнорадикальное окисление, с возможно более специфичным действием на определенные звенья этого процесса (перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, повреждение нуклеиновых кислот и т.д.).
Поиск антиоксидантов может проводиться по двум основным направлениям. Первое - это синтез новых соединений с выраженной антиоксидантной активностью, низкой токсичностью и минимальным проявлением побочных явлений. Второе - это поиск антиоксидантов среди широко используемых в медицинской практике лекарственных средств различных фармакологических групп, либо выявление таких соединений в природе [1, 3].
Следует обратить внимание на то обстоятельство, что антиоксиданты в зависимости от концентрации и других факторов могут проявлять либо антиоксидантное (защитное) действие, либо прооксидантное (проявление высокой токсичности, нежелательных побочных явлений), либо вообще не проявлять какого-либо эффекта на интенсивность накопления активных форм кислорода и скорость реакций свободнорадикального окисления.
Китайский дубовый шелкопряд (Antheraea pernyi G.-M.) издавна культивируется для изготовления натуральных шелковых тканей. В последнее время куколка шелкопряда рассматривается как исходное сырье для получения различных лечебных, косметических средств, пищевых продуктов (масла, приправы) и применяться в качестве кормовых добавок для домашних животных, птицы, рыбы [1, 8].
Куколка шелкопряда - это природный объект, содержащий биологическую жидкость, между стадиями двух эукариотических организмов - гусеницы и бабочки. Очевидно, что в этой жидкости должен содержаться оптимальный для синтеза белков эукариотического организма спектр аминокислот. Кроме того в жидкости куколок шелкопряда должны присутствовать молекулы, предохраняющие гемолимфу от окислительного стресса и инфицирования.
Установлено, что при фракционировании содержимого куколок на сефадексе G-25 получают три пика веществ, поглощающих ультрафиолет при длинах волн 260 и 280 нм. При диск-электрофорезе содержимого куколок китайского дубового шелкопряда выделяется 8 фракций белков, четко делящихся на три группы по электрофоретической подвижности белков.
Разделение методом тонкослойной хроматографии на силикагеле выявило наличие нескольких флуоресцирующих компонентов гемолимфы. Количественная реакция указывает на наличие дигидроксихинонов. Концентрация свободных низкомолекулярных продуктов, содержащих сульфгидрильные группы оказалась низкой ~ 10-6 М. В гемолимфе куколок присутствуют водо- и жирорастворимые витамины (особенно большое количество аскорбиновой кислоты). Общее количество свободных аминокислот в жидком содержимом куколок китайского дубового шелкопряда составляет 14-16 г/л, в том числе обнаружены (М±m, ммоль/л) глутамин (19,07±1,886), аланин (18,33±2,601), глицин (17,15±0,907), серин (13,13±1,711), треонин (10,28±0,272), гистидин (10,26±0,367), лизин (8,659±0,586), валин (8,162±0,193), пролин (5,586±0,409), лейцин (4,763±0,133), аспарагиновая кислота (4,700±0,561), изолейцин (4,337±0,145), тирозин (2,530±0,230), цитрулин (2,152±0,141), фенилаланин (1,043±0,070), таурин (0,976±0,112), глутаминовая кислота (0,899±0,081), метионин (0,672±0,083), бета-аланин (0,511±0,029), этаноламин (0,227±0,016), орнитин (0,044±0,004). Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии не выявлены аминокислоты аспарагин, цистеин и триптофан. По сравнению со спектром свободных аминокислот растений в жидком содержимом куколок содержится больше глицина, лизина, гистидина, пролина и глутамина, а также снижено содержание глутаминовой кислоты и фенилаланина. Аминокислотный состав куколок близок к биологически полноценным белкам молока [9-13].
В 2007 году был описан антиоксидантный эффект гемолимфы куколок китайского дубового шелкопряда [1, 14].
Оказалось, что антиоксидантный эффект гемолимфы куколок шелкопряда существенно превышает антиоксидантную активность гемолимфы виноградных улиток (Helix pomatia L.). При вычислении ингибирования образования активных форм кислорода (АФК) установлено, что гемолимфа куколок китайского дубового шелкопряда эффективнее гемолимфы виноградных улиток в системе люминол + HCl в 200 раз, люминол + миелопероксидаза хрена + Н2О2 в 200 раз, генерации АФК нейтрофилами при адгезии в 700 раз, генерации АФК нейтрофилами при действии хемотаксического пептида f Met-Leu-Phe в 300 раз и генерации АФК нейтрофилами при действии латекса в 4000 раз. Следовательно, уникальное антиоксидантное действие гемолимфы шелкопряда наблюдается при степени ее разбавления на несколько порядков более высокой, чем у виноградных улиток.
В аминокислотный состав гемолимфы куколок дубового шелкопряда входят тирозин и таурин. Эти аминокислоты являются типичными физиологичными субстратами миелопероксидазы (МПО) и выявляются в фаголизосомах нейтрофилов, где осуществляется внутриклеточная деструкция патогенного материала при инфекционном заражении. Было показано, что богатые тирозином пептиды и белки могут связываться с активным центром МПО и ингибировать пероксидазную и галогенирующую активность фермента в отношении других субстратов. Вероятно, механизм антиоксидантного и антимикробного действия гемолимфы куколок также включает связывание компонентов гемолимфы с реакционным центром МПО, что приводит к ингибированию ее активности [15-22].
Помимо активных форм кислорода и хлора чрезвычайно высокой реакционной способностью и токсичным действием в отношении биосистем обладают активные формы азота, в первую очередь, пероксинитрит ONOO-, образование которого также имеет место при воспалении и при действии ксенобиотиков. Хемилюминесцентным методом удалось показать, что компоненты гемолимфы взаимодействуют с ONOO-. Cубстратом нитрования в гемолимфе куколок, по-видимому, является тирозин, продуктом реакции - нитротирозин.
В опытах in vitro показано, что уровень восстановленного глутатиона в эритроцитах, подвергнутых действию окислителя (1 мМ tBOOH) в присутствие гемолимфы, был на 38 % выше, нежели в отсутствие протектора. Еще более выраженным антиоксидантным эффектом обладала гемолимфа шелкопряда, непосредственно извлеченная из куколки. Гемолимфа более чем на 65 % ингибировала процесс генерирования продуктов пероксидного окисления липидов в эритроцитах в присутствии 2 мМ tBOOH. Известно, что индуцируемое органическим пероксидом окислительное повреждение эритроцитов связано с генерацией алкоксильного и пероксильного радикалов в реакции окислителя с оксигемоглобином.
Можно предположить, что компоненты гемолимфы непосредственно взаимодействуют с образующимися радикалами либо ингибируют процессы их образования [23-26].
Установлено, что ни водный экстракт куколок тутового шелкопряда ни его фракции не оказали цитотоксического действия на культуру клеток нормальных фибробластов человека.
Таким образом, показано, что гидрофильные компоненты гемолимфы куколок дубового шелкопряда обладают антиоксидантным эффектом, взаимодействуют с системами антимикробной защиты, предохраняют мембраны клеток от пероксидного окисления липидов эукариотических клеток. Все вышеизложенное позволяет предложить использование водного экстракта куколок дубового шелкопряда или его фракций для оптимизации функционирования эукариотических клеток, в частности растительных клеток [1, 27-29].
Гомометаболические насекомые с полным превращением характеризуются тем, что у них между личиночной и взрослой стадиями происходит внезапная и резкая трансформация. Ювенильная личинка (гусеница) по мере роста претерпевает серию линек. Процесс линьки инициируется в мозге, нейросекреторные клетки которого в ответ на нервный, гормональный или средовый сигналы выделяют проторакотропный гормон (ПТТГ) - пептидный гормон с молекулярной массой 40 кДа, стимулирующий образование экдизона клетками проторакальной железы. С участием гидроксилазной системы периферических тканей экдизон превращается в активную форму - экдистерон. Развитие личинок до метаморфозной линьки контролирует ювенильный гормон, образуемый в прилежащих телах. В присутствии ювенильного гормона стимулирования экдизоном линька завершается переходом личинки в новый возраст. У личинок последнего возраста синтез ювенильного гормона постепенно прекращается и его содержание падает ниже порогового уровня. Это событие инициирует синтез экдизона и его превращение в экдистерон. Такой гормональный фон переводит клетки на путь, ведущий к окукливанию.
Личинка последнего возраста трансформируется в куколку. Куколка не питается, а живет за счет энергии пищи, потребляемой личинкой. В куколке происходят процессы гистолиза и гистогенеза. Гистолиз - разрушение подлежащих замене в ходе метаморфоза тканей и органов личинки, которое осуществляется при помощи автолиза, лиоцитоза и фагоцитоза. Содержимое куколки как бы возвращается к дифференцированному состоянию яйца. Гистолизу подвергаются все системы организма личинки, кроме нервной, половой, а также спинного сосуда. В дальнейшем гистолиз сменяется гистогенезом, конечной целью которого является построение из образовавшейся жидкой массы новых, имагинальных органов. Важную роль при гистогенезе также играют имагинальные зачатки - группы клеток, из которых возникают те или иные ткани и органы. Таким образом, в голометаболических личинках имеются две популяции клеток: личиночные клетки, функционирующие на ювенильных стадиях, и имагинальные клетки, собранные в кластеры, ждущие сигнала, чтобы приступить к дифференцировке [30]. Кроме того в гемолимфе обнаруживаются 5 типов циркулирующих гемоцитов: прогемациты (стволовые клетки), плазматоциты и три типа специализированных клеток [31, 32].
Ранее было показано, что реакции изолированных клеток на
действие гидрофильных компонентов куколок дубового шелкопряда зависят от типа
клеток и дозы экстракта: малые дозы стимулируют антиоксидантный эффект
нейтрофилов, а относительно высокие дозы активируют фагоцитоз макрофагами и
модулируют метаболизм и функции тканевых лимфоцитов [33].