Файл: Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра.pdf

цамн рибосом по РНК, по скорости осаждения в сахарозном гра­ диенте, но отличались большим содержанием белка. В электронном микроскопе ядрышковые 60S частицы были схожи с большими субъединицами цитоплазматических рибосом и с теми гранулами, которые видны в ядрышках на срезах. Такие же данные приведе­ ны и в других работах (Jzawa, Kawashima, 1969). В этих исследо­ ваниях подчеркивается, что ядрышковые рибонуклеопротеидные частицы более рыхлые и крупные, чем цитоплазматические, что может отражать различия в конформации их цепей РНП.

На основании современных данных Перри (Perry, 1969) пред­ лагает схему синтеза рибосом (см. стр. 60).

ДНК ядрышек

Блокада актиномицином синтеза рРНК указывает на то, что по­ следний должен осуществляться на матричной молекуле ДНК (Franklin, Baltimore, 1962). Биохимическими исследованиями об­ наружено в выделенных ядрышках определенное количество ДНК, которую можно отождествить с околоядрышковым хроматином или с ядрышковыми организаторами хромосом. Содержание ДНК в выделенных ядрышках составляет 5—12% от сухого веса (Busch et al., 1963) и 6—-17% от всей ДНК ядра (Me Leish, 1964).

Интересно было узнать, является ли эта ядрышковая ДНК спе­ цифической матрицей для синтеза рРНК или же это участки хро­ мосом, регулирующих работу ядрышка, а матричная рДНК распо­ лагается где-либо в других участках хромосом. Об этом можно было бы судить по нуклеотидному составу ядрышковой ДНК, так как ДНК, на которой синтезируется рРНК, должна обладать высоки]' содержанием гуанина и цитозина но сравнению с ДНК остального хроматина.

Однако прямой анализ нуклеотидного состава ДНК ядрышко­ вых фракций показал, что эта ДНК богата аденином и тимином, что характерно для основной массы ДНК (Busch et al., 1963). Та­ кой негативный результат не мог быть признан окончательным из-за возможности больших примесей соосажденного хроматина пли, наоборот, из-за потери части ядрышковой ДНК.

Другой прием для характеристики ядрышковой ДНК примени­ ли Збарский с сотр. (1964). Было замечено, что при экстракции ДНП из ядер 1,5 М раствором NaCl в последнюю очередь экстраги­ руются гетерохроматиновые околоядрышковые участки. Оказалось, что в экстрагированной части хроматина отношения пар нуклеоти­ дов Г+Ц : А + Т были равны 0,73, а в неэкстрагированной части приближались к значениям 0,93—1,24 (для рРНК отношение Г+Ц : А +У равно 1,5). Возможно, эти данные указывают на от­ личие ядрышковой ДНК от ДНК хроматина ядра и на гетероген­ ность этой ДНК. Повышение коэффициента специфичности этой

ДНК до 1,24 отражает обогащение околоядрышкового хроматина участками, богатыми Г- и Ц- основаниями.

Как известно, с помощью метода гибридизации РНК с ДНК было показано на бактериях (Spiegelman, Yankofsky, 1965), расте­ ниях (Chipchase, Birnstiel, 1963) и насекомых (Ritossa, Spiegel­ man, 1965), что около 0,3% ДНК этих организмов имеют нуклео­ тидную последовательность, комплементарную к рРНК и, следова­ тельно, определяющую состав этих РНК. Были предприняты по­ пытки анализировать этим методом локализацию матричной ДНК для синтеза рРНК.

В одной из работ объектом служили хорошо изученные в гене­ тическом и биохимическом отношениях шпорцевые лягушки X. 1аevis (Wallace, Birnstiel, 1966), на которых изучалась способность ДНК гибридизироваться с меченой рРНК этих животных. Для этого были использованы ДНК из животных дикого типа, имею­ щих два ядрышковых организатора, ДНК из гомозиготных му­ тантов, лишенных ядрышковых организаторов и неспособных об­ разовывать нормальные ядрышки, и ДНК из гетерозиготных осо­ бей, обладающих только одним организатором ядрышка. Гибриды рРНК — ДНК отделялись от некомплексированной денатуриро­ ванной ДНК в градиенте плотности хлористого цезия. Как оказа­ лось, самый высокий процент связывания рРНК с ДНК был у животных дикого типа, имеющих два ядрышковых организатора; комплексирование у безъядрышковых особей было очень низким, а у одноядрышковых занимало промежуточное положение (57% по сравнению с диким типом). Отсюда следует, что ДНК ядрыш­ кового организатора является той самой ДНК, на которой проис­ ходит синтез ядрышковой, т. е. рибосомной, РНК. На основе ана­ лиза насыщения ДНК при гибридизации с рРНК в этой работе делается также вывод о том, что цистроны, отвечающие за синтез рРНК, располагаются компактно и, возможно, представлены в виде полицистронного участка, входящего в состав ядрышкового ор­ ганизатора. Бирнстайл и др. (Birnstiel et al., 1966), анализируя уровень насыщения для рРНК, пришли к выводу, что на гаплоид­ ный геном приходится 500—800 комплементарных участков ДНК для каждой 28S и 18S рРНК.

В другой работе (Ritossa, Spiegelman, 1965) исследовалась ДНК из особей нормальных и мутантных линий дрозофилы с раз­ личным числом ядрышковых организаторов — от 1 до 4. В диком типе дрозофилы самцы и самки имеют по два ядрышковых орга­ низатора, самцы линии G-1 — только один, самцы линии G-31 — три, а при сложной гибридизации G-31 с диким типом можно по­ лучить самок с четырьмя ядрышковыми организаторами. Из осо­ бей этих четырех линий выделялась ДНК и исследовалось ко­ личество меченой рРНК, которая образовывала комплексы с ДНК. У ДНК одноядрышковых особей процент специфического

62 Интерфазное ядро

связывания с рРНК составлял 0,15%, у двухъядрышковых (дикий тип) — 0,27, у трехъядрышковых — 0,42, у четырехъядрышко­ вых — 0,54%, т. е. получена прямая зависимость количества связы­ вания меченой рРНК с ДНК из разных источников, соответственно их генетической конституции, и показано, что вся ДНК, компле­ ментарная рРНК, локализуется в ядрышкообразующем локусе хро­ мосом. Эти работы говорят о том, что в геноме клеток X. laevis и Drosophila ядрышковая ДНК представлена серией однозначных рибосомных цистронов. Возник вопрос, не отражает ли такая полицистронность результат временной активации синтеза рРНК. Ритосса и др. (Ritossa et al., 1966) показали на цыплятах, что клетки с низким уровнем синтеза рРНК (ядерные эритроциты и спермин) имеют такое же количество рДНК, как и клетки, активно синтези­ рующие рРНК (около ста рибосомных цистронов).

В последнее время решен вопрос о природе дополнительных ядрышек в ооцитах амфибий (Brown, Dawid, 1968; Macgregor, 1968; Gall, 1968; Birnstiel et al., 1969). Оказалось, что многочис­ ленные (более 1000) ядрышки ооцитов представляют собой истин­ ные ядрышки, возникшие в результате отделения от хромосом ядрышковых организаторов, функционирующих как дополнитель­ ные матрицы для синтеза рРНК. Это объяснило полученные при наблюдениях данные о том, что в ядрах ооцитов X. laevis содер­ жится в 1400—2000 раз больше рДНК, чем в соматических ядрах (Wallace, Birnstiel, 1966). В частности, Миллер с помощью элек­ тронного микроскопа (Miller, 1966, 1967; Miller, Beatty, 1969)

установил, что центральная фибриллярная зона дополнительных ядрышек содержит одну циркулярную молекулу ДНК, покрытую «матриксом» из РНК. «Матрикс» имеет вид сегментов (4—5 ми), длина которых соответствует длине цистрона рДНК для синтеза молекул предшественников рРНК. Этот «матрикс» состоит из мно­ гочисленных РНП-фибрилл, одним концом связанных с осью ДНК; в каждом цистроне рДНК одновременно синтезируется около 100 молекул рРНК.

Таким образом, биохимические исследования ядрышка показа­ ли, что в них происходит синтез рРНК на матричных ДНК ядрыш­ ковых организаторов. В ядрышке же, видимо, происходит и ассо­ циация рРНК с рибосомными белками. Все эти наблюдения позво ляют говорить о том, что ядрышко является местом синтеза кле­ точных рибосом.

Ультраструктура ядрышка

Данные о биохимическом составе ядрышек позволяют подойти к пониманию морфологических особенностей структуры этого орга­ ноида в зависимости от его функционального состояния.

При изучении большого числа различных клеток животных и растений отмечена волокнистая или сетчатая структура ядрышек, заключенная в более или менее плотную диффузную массу. Эту во­ локнистую структуру можно видеть в световом микроскопе на ок­ рашенных специальными методами препаратах и в живых интакт­ ных клетках. Эстабле и Сотэло (Estable, Sotelo, 1951) предложили названия для этих частей: волокнистая часть — «нуклеолонема» (pars nucleolonema) и диффузная, гомогенная часть — «аморфное вещество» или «аморфная часть» (pars amorpha). Оба эти участка ядрышка Фёльген-отрицательны. Сделанные почти одновременно с этим'электронномикроскопические исследования также выявили волокнисто-нитчатое строение ядрышек (Bernhard et al., 1952).

Однако такое нитчатое строение ядрышка не всегда четко вы­ ражено (Bernhard, 1966). У некоторых клеток отдельные нити нуклеолонем сливаются и ядрышки могут быть совершенно однород­ ными, как, например, в клетках карциномы Эрлиха.

Яри более пристальном изучении ядрышка можно заметить, что основные структурные компоненты ядрышка — плотные гра­ нулы диаметром около 150 А и тонкие фибриллы толщиной 40— 80 А. Пространственная композиция этих основных компонентов ядрышка и дает весь небольшой ряд его структурных модифика­ ций. Во многих случаях (ооциты рыб и амфибий, меристематические клетки растений) фибриллярный компонент собран в плотную центральную зону (сердцевина), лишенную гранул, а гранулы за­ нимают периферическую зону ядрышка. Между гранулами в этой зоне всегда наблюдаются рыхло расположенные фибриллы толщи­ ной 40—80 А. В ряде случаев (например, клетки корешков расте­ ний) в этой гранулярной зоне не наблюдается никакой дополни­ тельной структуризации. Но часто эта зона представлена обособлен­ ными нитчатыми структурами толщиной около 1500—2000 А, состо­ ящими из гранул и рыхло расположенных фибрилл. В данном слу­ чае эти нитчатые гранулярные периферические компоненты яд­ рышка соответствуют нуклеолонеме, а центральная фибриллярная часть — аморфной части. Фибриллярная часть ядрышка также не всегда собрана в компактную центральную зону. Например, в яд­ рышках печени, .кишечного эпителия, клеток хряща мышей фиб­ риллярные участки без особого порядка разбросаны среди грану­ лярных, нуклеолонемных, участков ядрышка (рис. 5, табл. 13).

Кроме этих двух компонентов ядрышек, в последнее время большое внимание уделялось строению околоядрышкового хрома­ тина. При альдегидных фиксациях (формалин, глютаральдегид) вокруг ядрышка выявляется компактная зона околоядрышкового хроматина. Такой конденсированный хроматин виден не только по периферии ядрышка, но и между петлями нуклеолонемы. Имен­ но в эти зоны хроматина включается Н3-тимидин (Granboulan, Granboulan, 1964). При обработке фиксированных формалином