Файл: Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра.pdf

Затем после переноса корешков в среду без радиоактивности про­ слеживалось перемещение метки в клетке. Через некоторое вре­ мя метка появлялась в цитоплазме, хотя до перенесения клеток в нерадиоактивную среду ее там не было. Такое перераспределение метки указывает на то, что ядрышковая РНК является предшест­ венником цитоплазматической РНК. К такому же выводу пришли Леблонд и Амано (Leblond, Amano, 1962), изучая на крысах ско­ рость включения Н3-цитидина в РНК ядрышка, ядра и цито­ плазмы.

Пеллинг (Pelling, 1964), исследуя включение Н3-уридина в хромосомы слюнных желез Chironomus, обнаружил, что первые следы включения видны только в области ядрышкового организа­ тора; при большем времени включения метка распространялась по всему ядрышку. Первичное включение Н3-уридина в области яд­ рышкового организатора подтверждает точку зрения о том, что ДНК этого района хромосом ответственна за синтез ядрышковой РНК. Аналогичные данные получили Сирлин и др. (Sirlin et al., 1961). Сходные результаты получены и на клетках высших жи­ вотных. Интересен ряд экспериментов с избирательным подавлени­ ем синтетической активности ядрышка. Перри и Эррера (Perry, Еггега, 1960) использовали тонкий луч ультрафиолетового света для избирательного поражения внутриядерных структур в живых клетках культуры ткани. Как оказалось, поражение участков хроматина не влияет на общий уровень включения метки в РНК ядрышка и цитоплазмы. При облучении ядрышка происходит 90%-ное подавление включения в него Н3-уридина. Если после облучения ядрышек в среду, где растут клетки, ввести Н3-урндин, то через 4 часа количество меченой РНК в ядре и цитоплазме, по сравнению с контролем, резко падает. Оказалось, что при облуче­ нии ядрышка количество метки в ядрах составляет 70% нормы, а в цитоплазме — только 30%. Следовательно, значительная часть меченой РНК, переходящей из ядра в цитоплазму, зависит от синтетической активности ядрышка.

Сходные данные получены при подавлении синтеза РНК с по­ мощью актиномицина. Перри (Perry, 1963) обнаружил, что, ис­ пользуя низкие дозы актиномицина (10~8М), можно избирательно подавлять включение предшественников в РНК ядрышка, тогда как уровень включения в хроматин ядра не изменяется. Одновре­ менно с прекращением включения Н3-уридина в ядрышко пре­ кращается появление метки и в цитоплазме. Как было показано в последующих работах (Perry, 1964), отсутствие метки в ядрышке в этих опытах связано с остановкой синтеза рибосомной РНК.

Прямые данные относительно природы ядрышковой РНК и ее связи с цитоплазматической РНК получены в ряде биохимичес­ ких исследований, особенно при анализе чистых фракций изоли­ рованных ядрышек.

Белки ядрышек

Так как ядрышко является самой тяжелой структурой в ядре, его нетрудно выделить из гомогенатов при центрифугировании. Чтобы получить чистые фракции ядрышек, свободные от приме­ сей, обычно используют дробное центрифугирование гомогенатов ядер в сахарозных растворах (Muramatsu et al., 1963; Birnstiel, Hyde, 1963) или центрифугирование в градиенте сахарозы (Maggio et al., 1963).

Анализы ядрышковых фракций, полученных разными исследо­ вателями, дают довольно сходные данные о количественном со­ держании белка, ДНК и РНК. Так, по данным Бирнстайла и Хай­ да (Birnstiel, Hyde, 1963), отношение белок : РНК : ДНК в ядрах

случае соотношение белок : РНК : ДНК в хроматине было 84: 2 : : 13,5, в ядрышке — 86 : 4 : 10. Очень близкие результаты получе­ ны для ядерных фракций клеток печени и опухолей крыс (Muramatsu et al., 1963).

Первые же анализы белков ядрышковых фракций из ооцитов морской звезды показали отсутствие в ядрышках гистонов (Vin­ cent, 1955). По данным Винсента, большая часть белков ядрыш­ ка представлена фосфопротеидами. Монти и др. (Monty et al., 1956) обнаружили в ядрышках гистоподобный белок. Однако в данном случае этот гистоновый белок мог отражать примесь хро­ матина в ядрышковой фракции, которая содержала много ДНК. Экстрагируя ядерные компоненты солевыми растворами, И. Б. Збарский и Г. П. Георгиев (1959) показали, что в состав ядрышек входит кислый белок, богатый РНК (15—17%).

Бирнстайл и др. (Birnstiel et al., 1964) также использовали со­ левые экстракции и показали, что основной белок ядрышек может включать в себя гистоновый и негистоновый белки. Используя экстракцию в дезоксихолате вместе с ультрацентрифугированием ядрышковых фракций, эти авторы описали четыре фракции яд­ рышковых белков:

1.Фракция белков, не связанных с частицами или осаждае­ мыми компонентами ядрышка, составляет около 7з общего коли­ чества белков ядрышка, хорошо экстрагируется при низких ион­ ных силах растворов.

2.Экстрагируемые рибонуклеопротеиды (РНП) составляют около ‘/з осаждаемых компонентов ядрышка; часть этой фракции содержит типичные рибосомы.

3.Остаточные РНП. Эта фракция сравнительно богата белка­ ми и также представляет около 7з осаждаемых фракций ядрышка.

56 Интерфазное ядро

Ранее этот компонент был идентифицирован в электронном мик­ роскопе как фибриллярный, устойчивый к экстракции 1 и 2М NaCl (Georgiev, Chentsov, 1962).

4. Фракция нуклеогистона, возможно, представляет собо ДНП с осажденного хроматина или ДНП околоядрышкового хро­ матина (ядрышкового организатора).

Из ферментов в ядрышках обнаружены щелочная фосфатаза, нуклеотидфосфорилаза и ДНП-синтетаза (Baltus, 1954). Браше (1960) считает, что одной из возможных функций ядрышек яв­ ляется синтез коферментов. В ядрышках обнаруживаются также РНК-полимераза и ряд ферментов, связанных с синтезом РНК и белка (Sirlin, 1962; Siebert, 1966).

Ядрышки, по-видимому, способны синтезировать белки. Так, выделенные ядрышки проростков гороха могут включать амино­ кислоты in vitro в остаточный, рибосомный белок (Birnstiel, Hyde, 1963). Исследуя способность изолированных ядер к белковому синтезу, Бирнстайл и другие (Birnstiel et al., 1962) нашли, что ядрышко — основное место синтеза белков в ядре. Эти данные подтверждены для ядрышек печени крыс (Rees et al., 1963). Кислоторастворимые белки ядрышек опухолевых клеток самые активные по включению меченого лизина.

РНК ядрышек

Оценивая общее содержание в ядрышковых фракциях белков, РНК и ДНК, можно видеть, что на долю РНК приходится немно­ гим более 10% всей массы ядрышка. Буш и др. (Busch et al., 1963), основываясь на своих исследованиях, считают, что количе­ ство РНК в ядрышке может достигать 5—14%. В клетках пече­ ни, например, содержание РНК в ядрышке составляет только около 4% (Maggio et al., 1963), тогда как в ядрышках пророст­ ков гороха оно доходит до 11% (Birnstiel, Hyde, 1963), а в яд­ рышках опухолей до 20% (Busch et al., 1963).

Большой интерес представляет выяснение природы ядрышко­ вой РНК. Поведение ядрышковой РНК при ауторадиографиче­ ских исследованиях говорило о возможном сходстве ее с РНК цитоплазмы. И действительно, нуклеотидный состав ядрышковой РНК очень близок к составу цитоплазматической РНК, а в неко­ торых случаях идентичен (Maggio еЦа1., 1963).

Так как основную массу цитоплазматической РНК составля­ ет рибосомная РНК (рРНК), то можно сказать, что и ядрышко­

вероятно, из-за того, что РНК ядрышковых фракций сильно дег­ радируют при разрушении ядер и в процессе приготовления пре­ паратов.

В связи с этим большой интерес представляло сопоставление поведения ядрышка и судьбы клеточных РНК в условиях изби­ рательного подавления синтеза РНК. Как уже указывалось выше, Перри (Perry, 1963) заметил, что низкие дозы актиномицина подавляют включение меченых предшественников в РНК ядры­ шек, не влияя на синтез РНК в хроматине. Следующие опыты Перри (Perry, 1964) были связаны с анализом тотальной РНК клеток культуры ткани в условиях подавления ядрышкового син­ теза. В нормальных условиях при кратковременном (около 30 мин.) контакте клеток с Н3-уридином выделенная новосинтезированная меченая РНК при фракционировании ее в сахароз­ ном градиенте распределяется в зонах 35—45 S и 4 S. Если после 30 мин. инкубации с предшественником клетки перенести в не­ меченую среду, то через некоторое время пики радиоактивности перемещаются в зоны 28S и 18S, характерные для рибосомной РНК.

В опытах с предварительным введением в среду актиномици­ на радиоактивности в зоне 35—45 S не появлялось, так же как не появлялась она позже в зонах рибосомной РНК. Если же актиномицин вводить после образования 35—45 S РНК, то переход метки в пики рибосомной РНК происходит. На основании данных этих опытов были сделаны некоторые выводы. Во-первых, новосинтезированная РНК с константами седиментации 35—45 S может представлять собой предшественник РНК рибосом. Во-вто­ рых, прекращение включения Н3-уридина в ядрышковую РНК при действии актиномицина (что показано ауторадиографиче­ ски), совпадающее с отсутствием включения метки в РНК в зоне

рующаяся в ядрышке, представляет собой рибосомную РНК. Аналогичные данные при изучении РНК «хромосомно-яд­

рышкового аппарата» получены Лерманом и др. (1964), которые также пришли к выводу, что ядрышко является структурой, на которой идет синтез рРНК и первые стадии образования рибосом. Сходные результаты о синтезе рРНК были получены на выделен­ ных ядрах (Penman, 1966). Те же самые характеристики име­ ет РНК, выделенная из изолированных ядрышек. Так, Мураматсу и др. (Muramatsu et al., 1966) в изолированных ядрышках печени крыс обнаружили 45 S, 35 S, 28 S и 6S рРНК; при помощи метки и воздействия актиномицином в этой работе было до­ казано, что 45 S РНК синтезируется в ядрышке и там же пере­

ходит в 35 S и 28 S РНК. Сходные данные получены при изуче­ нии РНК в изолированных ядрышках других объектов (Nakamuraiet al., 1967; Muramatsu, 1967; Willems et al., 1968).

Эти. наблюдения перекликаются с данными Брауна и Гэрдона (Brown, Gurdon, 1964), которые показали, что у эмбрионов гомо­ зиготных мутантных особей X. laevis, у которых отсутствуют яд­ рышковые организаторы и нет настоящих ядрышек, полностью отсутствует как синтез 28 S и 18 S рРНК, так и синтез их пред­ шественников (35 S РНК). С другой стороны, у нормальных особей начало синтеза этих рРНК совпадает с появлением ядрышка в клетках эмбрионов в начале гаструляции (Brown, 1964). Сход­ ные взаимоотношения, по-видимому, существуют между появле­ нием ядрышка и образованием рРНК и у других животных.

Подтверждением представлений о том, что ядрышко являет­ ся местом синтеза рРНК и образования рибосом, послужило то, что из ядрышковых препаратов были выделены РНП-частицы, которые как по составу РНК, по седиментационным свойствам, так и по размеру можно охарактеризовать как рибосомы. Они представлены в виде 39S, 60S и 81S частиц, их поведение в раст­ ворах с различной концентрацией магния точно такое же, как у рибосом цитоплазмы (Birnsteil, Hayde, 1963). Эти наблюдения хо­ рошо согласуются с многочисленными данными, полученными при электронной микроскопии ядрышек, в которых были обнару­ жены гранулы тех же размеров и свойств, что и рибосомы (см.

ниже).

Представления о том, что ядрышко служит местом сборки клеточных рибосом или их предшественников, нашли большое число подтверждений. Появились данные, показывающие, что из ядрышек можно выделить гетерогенные рибонуклеопротеидные частицы. Варнер и Соеро (Warner, Soeiro, 1967) изолировали из ядрышек клеток HeLa 80S и 55S рибосомные предшественники, содержащие 45S и 32S рРНК соответственно. Лиау и Перри

(Liau, Perry, 1968) обнаружили 62S, 78S, 95S и 110S частицы в ядрышках, которые содержали рибосомную РНК 28—45S. Эти авторы отмечают более низкую плотность этих частиц по сравне­ нию с цитоплазматическими рибосомами и считают, что при созре­ вании рибосом происходит потеря РНК и белка. Аналогичную схему образования рибосом у животных предлагает Маден (Маden, 1968). В ядрышках происходят переходы новосинтезирован-

ной рРНК: 45S РНК->- 32S PH K ^28S и 18S РНК. Начиная c45S

РНК, белок ассоциирует с рРНК, при этом образуются сначала тяжелые предшественники рибосом (около 80S и 60S), а потом уже и субъединицы рибосом (60S и 40S). Аналогичные данные получены и в других работах. Нараян и Бирнстайл (Narayan, Birnstiel, 1969) выделили из ядрышка частицы 55—80S, из которых 60S частицы были сходны с цитоплазматическими субъедини-