Файл: Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра.pdf

44 Интерфазное ядро

стки ядерной оболочки, не имеющие связи с хромосомами, также свободны от гранул. В ооцитах тритона на поздних стадиях разви­ тия, когда мейотические хромосомы собраны в центральной зоне, на ядерной оболочке нет такого гранулярного слоя.

По нашим наблюдениям, этот слой состоит из одного ряда гра­ нул величиной около 250—280 А, обладающих плотностью значи­ тельно большей, чем фибриллы хроматина. Эти гранулы погруже­ ны в слой аморфного вещества более низкой плотности. На танген­ циальных срезах видно, что эти плотные гранулы располагаются примерно на одинаковом расстоянии (около 250 А) одна от другой, и иногда виден гексагональный характер их укладки.

Зоны ядерных пор свободны от этого слоя. В ядрах с сильно разрыхленным хроматином в гипотонических растворах виден не­ посредственный переход хроматиновых фибрилл в эти гранулы, при этом создается впечатление, что к каждой грануле подходит одна фибрилла.

Химические свойства этого слоя изучены пока недостаточно. Так, Бартон и др. (Barton et al., 1971) показали его устойчивость к высоким концентрациям хлористого кальция. По нашим наблю­ дениям (Онищенко, Ченцов, 1972), в печени крыс после окраски по Бернхарду, выявляющей РНК-содержащие структуры, непо­ средственно под внутренней ядерной мембраной окрашивается слой толщиной около 100—150 А, однако дискретных гранул при этом не выявляется. При обработке выделенных в гипотонических сре­ дах ядер печени крыс разными агентами было показано, что грану­ лярный слой устойчив к обработке «Тритоном Х-100, РНК-азой, гиалуронидазой, фосфолипазой, дитиотриэтолом. Сахароза в кон­ центрациях 0,34 М также не вызывала никаких изменений в слое.

При действии ЭДТА, вызывающем уменьшение толщины фиб­ рилл ДНП от 200 до 100 А, этот слой сохраняется, но теряет чет­ кую структуру и становится тоньше. Обработка ядер растворами высокой ионной силы (0,4—0,6 М по NaCl) и проназой приводит к полному исчезновению этого слоя периферического хроматина.

После обработки выделенных ядер по Бартону «Тритоном Х-100» ядра сохраняют свою целостность до тех пор, пока остается интактным слой периферического хроматина. Повышение концент­ рации NaCl до 0,4—0,6 М приводит к быстрому растворению таких ядер, хотя в контроле без «Тритона Х-100» при этих концентраци­ ях солей ядра не исчезают. Быстрая дезинтеграция лишенных ядерной оболочки, но содержащих гранулярный слой ядер про­ исходит при действии на них проназы.

Как видно, поведение периферического гранулярного слоя при воздействии на него различных агентов сходно с поведением фиб­ рилл хроматина. Это проявляется в чувствительности к ЭДТА, в разрушении в гипертонических растворах. Правда, при концентра­ ции NaCl 0,4—0,6 М нуклеогистон лишь частично диссоциирует и

переходит в тонкие нити толщиной 60—100 А, а не полностью ра­ створяется. Все же нам кажется, что этот слой может представлять собой ДНИ, но, возможно, в ассоциации с иными белками, чем в ос­ новной массе хроматина.

На рис. 4 представлена грубая модель организации этого гра­ нулярного слоя периферического хроматина и его взаимосвязь с

другими элементами ядра.

Какова функциональная роль этого слоя, пока недостаточно ясно. Ясно лишь, что он может играть чисто структурную роль внешнего каркаса, который обеспечивает морфологическую цело­ стность ядра. Во всяком случае, он является структурой, опосреду­ ющей связь хроматина с ядерной оболочкой.

Другая возможность — участие этого слоя в процессах функцио­ нирования хроматина в интерфазном ядре. Основанием для тако­ го предположения послужили представления Жакоба и др. (Jacob et al., 1963) о связи хромосомы бактерий с плазматической мем­ браной. Эти авторы считают, что связь бактериальной ДНК с мем­ браной необходима не только для обеспечения пространственного разделения дочерних нуклеоидов после их репликации. Они вы­ двинули очень интересное предположение о том, что процессы реп­ ликации бактериальной ДНК происходят в области связи ДНК с мембраной и что именно в этой точке происходит инициация син-

Ф ДН П — ф и б р и л л ы Д Н П . Я д ер н ы е п опы д а н ы у п рощ ен н о

теза ДНК. В последнее время это представление Жакоба и др. (Jacob et al., 1963) было подтверждено многочисленными биохими­ ческими данными (Rosenberg, Cavaliery, 1968; Sueoka, Quinn, 1968).

Важно отметить, что в своей работе Жакоб и соавторы выска­ зали предположение, что такая же в принципе система фиксации репликонов служит основой для структуры хромосом высших ор­ ганизмов. Эта идея могла быть проверена экспериментально. Ко­ мингс и Какефуда (Comings, Kakefuda, 1968) на синхронизиро­ ванной избытком тимидина культуре клеток амниона человека с помощью электронномикроскопической ауторадиографии показа­ ли различие в локализации метки в ядре в зависимости от стадии синтеза ДНК. В самом начале периода синтеза метка располага­ лась по зоне ядерной оболочки и по периферии ядрышка. Затем метка появлялась и в более центральных участках ядра. Этим было показано, что у высших организмов инициация репликации ДНК может быть связана с ядерной мембраной. К сожалению, на других объектах эти наблюдения не подтвердились. Так, по данным Блондель (Blondel, 1968), при синхронизации клеток культуры КВ так­ же более активной по включению была периферия ядра, но в те­ чение всего S-периода, даже после смены радиоактивной среды на нерадиоактивную.

При репликации ДНК в ядрах лимфоцитов, стимулированных к делению фитогемагглютинином (Tokuyasu et al., 1968; Milner, Hayhoe, 1968; Milner, 1969), в самом начале синтеза метка Н3-ти-

мидина располагается не по периферии ядра, а на границе толсто­ го слоя конденсированного хроматина, который в это время начи­ нает переходить в диффузную форму. После полного перехода хроматина в диффузное состояние метка располагается преимуще­ ственно около ядерной оболочки. В другой работе (Erlandson, Нагven, 1971) при синхронизации клеток HeLa в начале S-периода метка распределена по ядру беспорядочно, она начинает локализо­ ваться на периферии лишь в конце периода синтеза ДНК. Эти неоднозначные цитологические наблюдения не позволяют сделать определенных выводов относительно функциональной значимости связи хроматина с ядерной оболочкой. Однако есть ряд биохимиче­ ских исследований, показывающих, что после разрушения мечен­ ных предшественниками ДНК ядер удается выделить фракцию, обогащенную новообразованной ДНК. Оказалось, что эта фракция представляет собой ДНК-мембранный комплекс (Fumio et al., 1971).

Представления, сходные со взглядами Жакоба и др. (Jacob et al., 1963), Комингса и Какефуды (Comings, Kakefuda, 1968), вы­ сказываются в теоретических построениях А. Н. Мосолова (1969). Они основаны на идее филогенетической преемственности в орга­ низации наследственного материала прокариотов и эукариотов.

Согласно этим представлениям, у эукариотических организмов в интерфазе ДНК хромосом фиксирована на ядерной мембране в точках начала репликации.

Сейчас еще рано делать окончательные выводы о природе и значимости связи хроматина с ядерной оболочкой. Возможно, что эта связь определяет не только инициацию, но и весь процесс репликации ДНК; вполне вероятно, что такая функциональная связь обязательна не для всей массы ДНК, а для определенных районов хромосомы.

Видимо, тесная структурная связь хроматина с периферией ядра может быть не обязательно связана с синтезом ДНК. Так, было показано, что как реплицирующийся, так и нереплицирующийся хроматин в клетках яйцевых оболочек личинок мучного клеща имеет сходную локализацию и структуру (Pawlowski, Вегlowitz, 1969).

Ультраструктура хроматина на различных стадиях митотического цикла

В этом разделе рассматриваются немногочисленные данные об ультраструктурных изменениях хроматина в пнтерфазных яд­ рах в течение предсиптетического (Gi), синтетического (S) и по­ стсинтетического (G2) периодов клеточного цикла. Вопрос об из­ менениях, связанных с образованием митотических хромосом, бу­ дет рассмотрен особо (см. стр. 107).

Если рассматривать структуру интерфазных ядер на ультратонких срезах в электронный микроскоп, то, как и в световом микроскопе, бросается в глаза то, что хроматин в ядре может су­ ществовать в двух формах: диффузной и конденсированной. Об­ щность этих форм заключается в том, что в обоих случаях основ­ ной структурной единицей являются элементарные фибриллы хроматина толщиной около 200—250° А. Различием же является степень плотности упаковки этих фибрилл. Плотные сгустки или тяжи конденсированного хроматина в литературе обычно опреде­ ляются как участки гетерохроматина. А. А. Прокофьева-Бельгов- ская (1971) обращает внимание на необходимость различать вы­ сокоспецифические гетерохроматические районы хромосом, отли­ чающиеся от эухроматических рядом физиологических и функ­ циональных особенностей, и гетерохроматизированные районы, каковыми могут быть участки как эухроматических, так и гетеро­ хроматических райопов. Гетерохроматизированные участкп (или гетеропикнотизированные) характеризуются тем, что в пнтерфазном ядре они представляют собой компактные конденсированные тела с инактивированными генами. Частота встречаемости и лока­ лизация таких участков конденсированного, гетеропикнотического, хроматина могут быть различны в ядрах разных объектов

48 Интерфазное ядро

(табл. 10). Так, например, в ядрах лейкоцитов почти весь хрома­ тин находится в конденсированном состоянии и располагается в виде толстого слоя плотно упакованных фибрилл на периферии ядра. Такое состояние хроматина коррелирует с низким метабо­ лическим уровнем активности такого типа ядер. В клетках с вы­ соким уровнем активности в отношении синтеза РНК и ДНК доля конденсированного хроматина, наоборот, мала. В таких ядрах (бластные клетки, эмбриональные клетки) большая часть объема занята диффузно расположенными фибриллами ДНП. Встречающиеся в этих случаях отдельные глыбки гетеропикнотического хроматина располагаются в толще ядра (хромоцентры) или чаще около ядрышка и вблизи ядерной оболочки.

Сложная и довольно пестрая картина в распределении хрома­ тина отмечена в ядрах клеток растений (см., например, классифи­ кацию Данжара 1950). Здесь чаще встречаются крупные зоны гетеропикнотизированного (конденсированного) хроматина. В ря­ де объектов такой конденсированный хроматин образует множе­ ство хромоцентров, нередко расположенных на ядерной оболочке (Allium fistulosum). В других случаях большая часть объема за­ нята конденсированным хроматином в виде довольно толстых (0,1 — 0,3 мк) нитчатых участков — хромонем (см. ниже).

Такие формы распределения хроматина в ядрах существенно меняются при смене фаз ядерного цикла. Как уже указывалось, в лимфоцитах при стимуляции синтеза ДНК происходит посте­ пенное разрыхление и переход в диффузное состояние перифе­ рического хроматина (Milner, 1969). По данным Токуиасу и др. (Tokuyasu et al., 1968), в «покоящихся» лимфоцитах большая часть хроматина представлена в виде конденсированного хрома­ тина, образующего подобие сети из крупных и мелких агрегатов. В начале синтеза ДНК начинают исчезать мелкие агрегаты, пере­ ходя в диффузную форму хроматина, затем практически весь конденсированный хроматин переходит в диффузное состояние. При переходе клеток в позднюю Иг-стадию снова наблюдается конденсация хроматина, но связанная уже с формированием профазных хромосом.

Постепенное уменьшение количества конденсированного хро­ матина при переходе клеток из Gi-периода в S-период и последую­ щее увеличение количества гетеропикнотического хроматина по мере приближения клеток к митозу, показано на клетках HeLa, у которых ядра характеризуются вообще малой степенью конденса­ ции хроматина (Erlandson, Harven, 1971). Такую динамику изме­ нения хроматина на ядрах низкодифференцированных клеток все же проследить удается не всегда (Blondel, Tolmach, 1965).

В растительных клетках с хромонемной структурой ядер Лафонтэн и Лорд (Lafontaine, Lord, 1969) отмечали утолщение конденсированных сегментов хроматина в S-периоде в два раза