Файл: Физикохимическая биология 33.pdf

Физико-химическая биология
33
УДК 579.222:579.6 DOI: 10.24412/2071-6176-2021-2-33-41 ВЫДЕЛЕНИЕ ГЛИКОЛИПИДНЫХ БИОСУРФАКТАНТОВ,
ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ RHODOCOCCUS SP.3-2, МЕТОДОМ ЭКСТРАКЦИИ
Т.И. Леонова, Е.В. Акатова, И.Ф. Пунтус Исследована способность бактерий Rhodococcus sp.3-2 продуцировать глико- липидные биосурфактанты приросте на н-гексадекане в жидкой минеральной среде при 26 о
С. Установлено, что эти микроорганизмы являются эффективными продуцентами биосурфактантов: через 7 сут культивирования выход гликолипидных био- сурфактантов достигает 0,86 гл. Качественный анализ липидных компонентов, про- дуцируемых штаммом микроорганизмов, методом тонкослойной хроматографии позволил установить, что гликолипидные биосурфактанты относятся к клеточно- ассоциированным. Ключевые слова биодеградация, экстракция, гексадекан, гликолипидные био-
ПАВ, Rhodococcus, трегалолипиды. Введение
Биосурфактанты (биоПАВ) – это амфипатические поверхностно- активные соединения, основной функцией которых является снижение поверхностного натяжения на границе раздела двух фаз. Структура биоПАВ представлена двумя функциональными составляющими гидрофобной неполярной и гидрофильной полярной, что даёт им возможность вступать во взаимодействие с соединениями различной полярности [1]. Биосурфактанты в сравнении с химически синтезированными сурфактантами имеют ряд преимуществ, такие как отсутствие токсичности, биоразлагаемость, высокая биологическая активность и др. [2]. В связи с этим биосурфактанты находят всё более широкое применение в разнообразных областях биотехнология защиты окружающей среды, нефтедобывающая и нефтеперерабатывающая, химическая, пищевая, фармацевтическая промышленность, а также косметология и медицина. По молекулярной массе среди биосурфактантов выделяют две основные группы. В первую группу входят низкомолекулярные соединения. К ним относят гликолипиды (глюколипиды, рамнолипиды, трегалозолипиды, софоролипиды) и липопептиды
(сурфактины, стрептофактины, полимиксины). Их главная роль заключается в эффективном снижении поверхностного и межфазного натяжения [3]. Ко второй группе относят высокомолекулярные соединения, которые называют эмульсанами или биоэмульгаторами, обладающими высокой эмульгирующей активностью [4].

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2021. Вып. 2 34 Наибольший интерес для изучения представляет класс гликолипидных биосурфактантов. Известно, что для микроорганизмов рода Rhodococcus характерно образование поверхностно-активных веществ гликолипидной природы в ответ на присутствие в питательной среде алканов [5, 6]. Такие вещества представляют собой один или два не восстанавливающих дисахарида трегалозы
(С
12
Н
22
О
11
(
-D- глюкопиранозил-1,1-
-D-глюкопираноза) ), связанных с миколовыми кислотами
– длинноцепочечными
-разветвлёнными--гидрокси- лированными жирными кислотами с различной длиной углеродной цепи
[7]. Бактерии рода Rhodococcus продуцируют два основных типа трегалолипидных биоПАВ: клеточно-ассоциированные (эндо-тип) [8] и внеклеточные (экзо-тип) [9]. Имеются данные, что родококки продуцируют преимущественно клеточносвязанные биосурфактанты [10]. Следует отметить, что тип и строение биоПАВ зависят от вида и штамма бактерий, субстрата и условий культивирования [15]. Поскольку ещё не имеется единого методологического подхода по выделению и обнаружению поверхностно-активных веществ, продуцируемых микроорганизмами, необходимо изучение и осуществление подбора эффективных методик для конкретного штамма родококков. Rhodococcus sp.3-2 был выделен из загрязненной почвы, взятой на территории нефтяного месторождения Ямало-Ненецкого автономного округа (ЯНАО). Штамм способен расти в среде с гексадеканом, дизельным топливом и нефтью в качестве единственных источников углерода. Приросте в среде с гексадеканом эффективно снижает поверхностное натяжение за счет продукции биосурфактантов. Целью данной работы является разработка эффективной методики выделения гликолипидных биосурфактантов, продуцируемых бактериями
Rhodococcus sp.3-2. Экспериментальная часть Объект исследования. Штамм бактерий Rhodococcus sp. 3-2 взят из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН г. Пущино. Условия культивирования. Микроорганизмы культивировали на жидкой минеральной среде Эванса следующего состава (на 1 л K
2
HPO
4
–
8,71 г М NH
4
Cl –1 мл 0,1 М Na
2
SO
4
– 1 мл 62 мМ MgCl
2
– 1 мл 1 мМ
CaCl
2
– 1 мл 0,005 мМ (NH
4
)
6
Mo
7
O
24
– 1 мл микроэлементы (состав в 1% растворе HCl, гл ZnO – 0,41; FeCl
2
-2,9; MnCl
2
– 1,28; CuCl
2
– 0,13; CoCl
2
– 0,26; H
3
BO
3
– 0,06). Готовую среду Эванса титровали М HCl до рН=7,0; стерилизовали в течение 30 мин при 121 С. Бактерии выращивали на жидкой минеральной среде Эванса в течение 48 ч для получения инокулята. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах
Эрленмейера объѐмом 750 мл на орбитальной качалке (при 26 С, n = 180

Физико-химическая биология
35 об/мин) в течение 7 сут в присутствии н-гексадекана (2% от об) как единственного источника углерода и энергии. Рост микроорганизмов и продуцирование биосурфактантов. Для отслеживания динамики продукции микроорганизмов и проведения количественного анализа снимали кривые роста. н-Гексадекан (2 % от об) добавляли к среде Эванса перед автоклавированием. В конические колбы, содержащие 100 мл питательной среды, вносили 2 мл тщательно перемешанного инокулята. Колбы помещали в термостатируемую орбитальную качалку
«Excella
25»
(Eppendorf, Германия. Культивирование проводили при температуре 26 о
С и аэрации с частотой вращения 180 об/мин. Через определённый промежуток времени из колб отбирали по 2 мл суспензии и измеряли оптическую плотность при длине волны 590 нм на спектрофотометре Эксперт (Эконикс-Эксперт, Россия. Время каждого измерения фиксировали. Для дальнейшего анализа были взяты три точки, соответствующие трём периодам стационарной фазы. Определение биосурфактантов фенольно-серным методом. Для определения содержания трегалолипидов из культуральной жидкости предварительно удаляли клетки центрифугированием в течение 10 мин при
10 000 об/мин. Содержание биосурфактанта оценивали по концентрации сахаров в пробеспектрофотометрически фенольно-серным методом [13], предварительно построив градуировочную зависимость по соответствующему дисахариду трегалозе. Выделение гликолипидных биосурфактантов. Гликолипидные биоПАВ выделяли из бесклеточного супернатанта и культульной жидкости экстракцией следующими растворителями этилацетат, система хлороформ:метанол (3:1), хлороформ. Бесклеточный супернатант получали центрифугированием культуральной среды при 10 000 g в течение 10 мин. Пробы, экстрагируемые системой хлороформ:метанол, подкисляли до рН 2 и оставляли нач при 4 С. Пробы, экстрагируемые хлороформом и этилацетатом, подкисляли до рН 3,5. Все пробы насыщали NaCl. Соотношение пробы и растворителя 3:1. Отбирали органический слой, растворитель удаляли на ротационном испарителе ИР – 1 ЛТ, Labtex при
36 Си давлении 0,2 атм. Незадолго перед окончанием упаривания добавляли бензол для получения азеотропа и лучшего удаления следов воды, и упаривали досуха. Тонкослойная хроматография (ТСХ). Разделение компонентов проводили на пластинах TLC Silica gel 60 F
254
(«Merck», Germany). В качестве подвижной фазы использовали систему хлороформ:метанол:вода
(65 : 15 : 2 об/об/об). Для обнаружения гликолипидов пластины обрабатывали нафтольным реагентом (0,25 г нафтола в 50 мл смеси метанол:вода (1:1, об/об), затем 10 ной серной кислотой, и нагревали

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2021. Вып. 2 36 при 110 С до максимального проявления окраски. Гликолипиды проявлялись в виде сине-фиолетовых пятен. Обсуждение результатов Штамм Rhodococcus sp. 3-2 культивировали при 26 о
С на минеральной среде Эванса, содержащей н-гексадекан в количестве 2 % от объёма. Рост микроорганизмов наблюдался преимущественно на поверхности питательной среды в виде биоплёнки, что может свидетельствовать о продуцировании биоПАВ эндо-типа [15]. Для выявления динамики роста бактерий измеряли оптическую плотность культуры через определённые промежутки времени (рис. 1). Это было необходимо для количественного определения выхода биосурфактантов на различных этапах роста. Время культивирования, ч 50 100 Оптическая плотность, о пт
.е д 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Рис. 1. Кривая роста бактерий Rhodococcus sp. 3-2 на н-гексадекане в периодической культуре Следует отметить, что длительность роста и время выхода культуры на стационарную фазу у штамма Rhodococcus sp. 3-2 выше, чему других родоккоков-нефтедеструкторов R. erythropolis S67 и R. erytropolis X5 из коллекции лаборатории биологии плазмид РАН [12]. Количественный анализ биосурфактантов по фенольно-серному методу.
Количество продуцируемых трегалолипидов определяли вначале стационарной фазы и по мере её развития спектрофотометрически фенольно-серным методом. Определение биосурфактантов проводили по измерению содержания трегалозы в образце бесклеточного супернатанта и делали дальнейший пересчёт на трегалолипиды. Количество продуцируемых Rhodococcus sp. 3-2 биосурфактантов увеличивается во времени (ее и е сутки) и составляет от 0,24 до 0,87 гл в конце культивирования, те. для целенаправленного получения биоПАВ необходимо культивировать культуру более семи суток. Штамм
Rhodococcus sp. 3-2 является лучшим продуцентом трегалолипидов (0,87 гл) по сравнению си (при 26 С около

Физико-химическая биология
37 0,3 гл для обоих штаммов, а также со штаммом R. sp. PLM026 (при 19 С около 0,3 гл) (рис. 2). Рис. 2. Динамика продукции биоПАВ в период стационарной фазы штамма Rhodococcus sp. 3-2 Качественный анализ методом тонкослойной хроматографии. Выделение гликолипидных биосурфактантов из двух фракций проводили экстракцией различными растворителями. Выделенные компоненты разделяли методом тонкослойной хроматографии. Для обнаружения на хроматограмме гликолипидов применяли нафтольный реагент – специфический проявитель для сахаров, который позволяет идентифицировать гликолипиды среди других липидных компонентов. На хроматограммах проб культуральной жидкости, экстрагированных этилацетатом и системой хлороформ:метанол, наблюдали по одному интенсивно окрашенному размытому пятну и два менее интенсивных и меньших по размеру пятна в каждом из образцов риса, в. На хроматограммах культуральной жидкости, экстрагированной хлороформом, наблюдали проявление одного слабо окрашенного сине-фиолетового пятна. Также было обнаружено пятно на линии старта, что связано с присутствием воды в образце, которую не удалось полностью удалить из пробы с помощью сульфата натрия, вследствие чего чёткого разделения компонентов не было достигнуто (рис. д. При проявлении хроматограмм проб бесклеточного супернатанта, экстрагированных хлороформом и системой хлороформ:метанол наблюдали проявление одного слабоокрашенного пятна в средней части хроматограммы, в пробе с этилацетатом проявление пятен не было обнаружено (рис. б, г, е. Полученные данные подтверждают наличие углеводной части молекулы, соединения, проявленные в виде сине-фиолетовых пятен, относятся к гликолипидным биоПАВ. Пятна, обнаруживаемые у линии финиша, не относятся к гликолипидам, однако могут проявляться при

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2021. Вып. 2 38 использовании реагента нафтола. Для полученных хроматограмм по наиболее проявленным пятнам были определены величины удерживания
R
f
, которые представлены в таблице. Рис. 3. Хроматограммы неочищенных липидных экстрактов бактерий
Rhodococcus sp. 3-2: а – культуральная жидкость б – бесклеточный супернатант (растворитель этиловый эфир уксусной кислоты в – культуральная жидкость г – бесклеточный супернатант (система растворителей хлороформ:метанол 3:1); д – культуральная жидкость, е – бесклеточный супернатант (растворитель – хлороформ) Значения величин удерживания R
f гликолипидов по результатам ТСХ Штамм м/о Экстрагент Экстракт
R
f1
R
f2
R
f3
Rh. sp. 3-2 Этилацетат
Культуральная жидкость
0,38 0,58 0,63
Rh. sp. 3-2 Смесь хлороформ- метанол (3:1)
Культуральная жидкость
0,35 0,53 0,56 Вещества с величиной удерживания 0,35 и 0,38 являются наиболее окрашенными и обнаружены только в пробах культуральной жикости, а соединения с R
f
0,56-0,63 обнаруживаются как в культуральных, таки в бесклеточных экстрактах, таким образом, у бактерий Rhodococcus sp. 3-2 преобладают гликолипидные компоненты эндо-типа (связанные с

Физико-химическая биология
39 клеточной стенкой. Компоненты могут иметь структурные различия, однако все содержат углеводы. Сравнение полученных данных сданными других авторов [11, 14], позволяет заключить, что штаммы бактерий Rhodococcus дают разные хроматограммы с различным количеством пятен и величинами удерживания, однако одно вещество (с R
f
0,35-0,39), которое проявляется, как наиболее окрашенное крупное пятно, присутствует в культуральной среде всех исследуемых в нашей научной группе родоккоков. Заключение Бактерии рода Rhodococcus являются эффективными продуцентами биосурфактантов через 7 суток культивирования выход биоПАВ составляет 0,87 гл. На основании полученных хроматограмм гликолипидные компоненты были обнаружены во всех экстрактах, наиболее эффективными экстрагентами являются этиловый эфир уксусной кислоты и система растворителей хлороформ:метанол. В результате ТСХ три наиболее интенсивно окрашенных сигнала свидетельствуют о присутствии нескольких гликолипидных веществ различных по структуре и об их ассоциации с клеточной стенкой бактерий, поскольку большая часть сигналов обнаружена в экстрактах культуральной жидкости. Список литературы
1. Елисеев С.А., Кучер Р.В. Поверхностно-активные вещества и биотехнология. Киев Наукова думка, 2001. 260 с.
2. Soberon-Chavez G., Maier R.M. Biosurfactants: a general overview.
Berlin, Heidelberg: Biosurfactants, microbiology monographs, 2011. 123 p.
3. Ron E.Z., Rosenberg E. Natural roles of biosurfactants. Environ
Microbiol, 2001. V. 3. № 4. 36 p.
4. Isolation and Analysis of Lipopeptides and High Molecular Weight
Biosurfactants / T.J.P. Smyth, A. Perfemo, I.M. Banat [et al.] // Springer Berlin
Heidelberg: Berlin. 2010. P. 3687-3704.
5. Niescher S., Lang S., Kaschabek S.R, Schlomann M. Identification and structural characterization of novel trehalose dinocardiomycolates from n- alkane - grown Rhodococcus opacus 1CP // Appl Microbiol Biotechnol.
2006. V. 70. P. 605-611.
6. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction / M. S. Kuyukina, I. B. Ivshina, J. C. Philp [et al.] // Journal of
Microbiological Methods. 2001. V. 46. I. 2. P. 149-156.
7. Asselineau C., Asselineau J. Trehalose-containing glycolipids //
Progress in the Chemistry of Fats and other Lipids. 1978. V. 16. P. 59-99.

Известия ТулГУ. Естественные науки. 2021. Вып. 2 40 8. Cirigliano M.C., Carman G.M. Purification and Characterization of
Liposan, a Bioemulsifier from Candida lipolytica //Appl. Environ. Microbiol,
1985 V. 50. № 4. P. 846-50.
9. Singer M.E.V., Finnerty W.R. Physiology of biosurfactant synthesis by Rnodococcus species H13-A // Can. J. Microbiol, 1990.V.36. P.741-745.
10. Formation, isolation and characterization of trehalose dimycolates from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes / P. Rapp, H. Bock, V.
Wray [et al.] // Microbiology, 1979. Т. 115. №. 2. Р. 491-503.
11. Бактерии-нефтедеструкторы рода потенциальные продуценты биосурфактантов / Т. М. Лыонг, И.А. Нечаева, КВ. Петриков и др // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. №. 1
(16).
12. Дмитриева ЕД, Леонтьева ММ, Каримова ВТ. Влияние гуминовых веществ торфов на ростовые параметры микроорганизмов нефтедеструкторов рода Rhodococcus в присутствии гексадекана // Ученые записки Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского. Биология. Химия. 2018. Т. 4. №. 2. Р. 43-56.
13. Colorimetric method for determination of sugars and related substances / МКА. Р. 350-356.
14. Characterization of biosurfactants produced by the oil-degrading bacterium Rhodococcus erythropolis S67 at low temperature / T.M. Luong, O.N.
Ponamoreva, I.A. Nechaeva [et al.] // World Journal of Microbiology and
Biotechnology. 2018. V. 34. I. 2. Р. 1-10.
15. Влияние пониженной температуры на биодеградацию гексадекана бактериями-нефтедеструкторами Rhodococcus sp. Х, продуцирующими гликолипидные биологические поверхностно-активные вещества / М. Лыонг, И.А. Нечаева, ОН. Понаморева и др Биотехнология. 2017. Т. 33. №. 6. С. 49-56.
Леонова Татьяна Игоревна, студентка, tatyanka-leonova-99@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Акатова Екатерина Валентиновна, канд. биол. наук, доц, katiaakatova@gmail.com, Россия, Тула,
Тульский государственный университет,
Пунтус Ирина Филипповна, канд. биол. наук, с.н.с, доц, puntus66@mail.ru, Россия, Пущино, Московская область, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
ISOLATION OF GLYCOLIPID BIOSURFACTANTS PRODUCED
BY BACTERIA RHODOCOCCUS SP. 3-2 BY EXTRACTION METHOD
T.I. Leonova, E.V. Akatova, I.F. Puntus

Физико-химическая биология
41
The ability of bacteria Rhodococcus sp. 3-2 to produce glycolipid biosurfactants dur- ing growth on n-hexadecane in a liquid mineral medium at 26 ° C was studied. It was found that these microorganisms are effective producers of biosurfactants: after 7 days of cultiva- tion, the yield of glycolipid biosurfactants reaches 0.86 g/l. A qualitative analysis of lipid components produced by a strain of microorganisms by thin layer chromatography made it possible to establish that glycolipid biosurfactants are cell-associated.
Keywords: biodegradation, extraction, hexadecane, glycolipid bio-surfactants,
Rhodococcus, trehalolipids.
Leonova Tatiana Igorevna, student, tatyanka-leonova-99@mail.ru, Russia, Tula,
Tula State University,
Akatova Ekaterina Valentinovna, candidate of biological sciences, associate professor, katiaakatova@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University,
Puntus Irina Filippovna, candidate of biological sciences, research associate, associate professor, puntus66@mail.ru, Russia, Pushchino, Moskovskaya oblast, Institute of
Biochemistry and Physiology of Microorganisms named after G.K. Scriabin RAS