Файл: П. Г. Демидова Кафедра органической и биологической химии А. С. Лебедев В. Ю. Орлов Лабораторный контроль лекарственных средств в соответствии с правилами glp и gmp учебнометодическое пособие.pdf
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 03.02.2024
Просмотров: 45
Скачиваний: 0
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
13
Таблица 2
Валидация различных типов аналитических методик
Наименование характеристики
Основные типы методик
Испы- тание на под- лин- ность
Посторонние примеси
Количествен- ное содержа- ние основного действующего в-ва, норми- руемых ком-в
Колич. мето- дики
Предел содер- жания
Специфичность**
Да
Да
Да
Да
ПОМ
Нет
Нет****
Да
Нет
ПКО
Нет
Да
Нет
Нет
Линейность
Нет
Да
Нет
Да
Аналитическая область
(диапазон применения)
Нет
Да
Нет
Да
Правильность
Нет
Да *
Да
Прецизионность:
- повторяемость
- внутрилаб. прецизионность
Нет
Нет
Да
Да***
Нет
Нет
Да
Да***
Устойчивость
(робастность)
Нет *
* — Может определяться при необходимости.
** — Отсутствие специфичности одной аналитической мето- дики может быть компенсировано использованием другой анали- тической методики.
*** — Если определена воспроизводимость, определение промежуточной прецизионности не требуется.
****
— Может потребоваться в некоторых случаях (напри- мер, когда предел обнаружения и нормируемый предел содержа- ния определяемой примеси близки).
14
Рассмотрим указанные характеристики более подробно.
Специфичность (specificity)
Способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество при наличии сопутствующих компонентов.
Изучение специфичности необходимо осуществлять в ходе валидации испытаний на идентификацию, примеси и количе- ственное определение (все типы методик). Процедуры подтвер- ждения специфичности зависят от целевого назначения аналити- ческой методики.
Доказательство специфичности валидируемой методики обычно основывается на рассмотрении полученных с ее исполь- зованием данных анализа модельных смесей известного состава.
Специфичность валидируемой методики может быть доказана также соответствующей статистической обработкой результатов анализов реальных объектов, выполненных с ее использованием, и, параллельно, с использованием другой, заведомо специфичной методики (специфичность которой доказана).
Специфичность для различных видов испытаний означает следующее.
1. При испытании на идентификацию — подтверждение того, что методика позволяет идентифицировать именно опреде- ляемое вещество.
2. При испытании на примеси — подтверждение того, что методика позволяет правильно распознать примеси в образце
(например, испытание на родственные соединения, тяжелые ме- таллы, содержание остаточных растворителей и т. д.).
3. При количественных испытаниях — подтверждение то- го, что методика позволяет установить содержание или актив- ность именно определяемого вещества в образце.
Примеры тестов на специфичность:
1. Качественные реакции (не всегда высокая специфичность, часто требуется дополнительное подтверждение).
2. Определение физико-химических констант (в основном для субстанций): температура плавления, показатель преломле- ния, температура кипения (для растворителей), pH раствора, те- сты на растворимость и т. д.
15 3. Физико-химические методы:
ИК-спектроскопия,
УФ-спектроскопия (идентичность спектров, идентичность мак- симумов), ВЭЖХ (время удерживания, сигнальные отношения, соответствие спектральных характеристик) и т. д.
Предел обнаружения методики (limit of detection)
Наименьшее количество (концентрация) определяемого ве- щества в образце, которое может быть обнаружено (или прибли- женно оценено) с использованием валидируемой методики.
Возможны различные подходы к определению предела обна- ружения в зависимости от того, является методика инструмен- тальной или неинструментальной. Выделяют визуальную оценку, оценку по соотношению «сигнал/шум», по стандартному откло- нению сигнала и наклону калибровочной кривой, по стандартно- му отклонению калибровочного раствора.
Визуальная оценка может использоваться как для неинстру- ментальных, так и для инструментальных методик. Предел обна- ружения устанавливается путем анализа проб с известными кон- центрациями определяемого вещества и определения его мини- мального содержания, при котором оно достоверно обнаружива- ется (положительный контроль).
Подход по соотношению «сигнал/шум» применим только к аналитическим методикам, для которых наблюдается шум базо- вой линии. Определение отношения «сигнал/шум» проводится методом сравнения сигналов, полученных от проб с известными низкими концентрациями, с сигналами, полученными от холо-
стых проб, и установления минимальной концентрации, при ко- торой определяемое вещество может быть достоверно обнаруже- но. Для оценки предела обнаружения приемлемой считается ве- личина отношения «сигнал/шум» от 3:1 до 2:1.
При оценке ПОМ (LOD) по наклону калибровочной кривой применяется следующая формула (1):
3.3*
y
S
LOD
b
(1)
S
y
— стандартное отклонение аналитического сигнала (ам- плитуда, площадь и т. д.); b — тангенс угла наклона калибровочной кривой.
16
Оценка ПОМ может проводиться и по стандартному откло- нению холостой пробы. При этом измеряется величина аналити- ческого сигнала для достаточного количества холостых проб и рассчитывается стандартное отклонение (2) их значений (S):
2 2
1
(
)
1
n
i
i
Y Y
S
S
n
(2)
S
2
— выборочная дисперсия;
n – 1 — число степеней свободы;
Y
i
— действительное значение сигнала.
При оценке ПОМ по стандартному отклонению калибровоч- ного раствора следует провести анализ одного и того же стан- дартного раствора 8–20 раз. Концентрация стандартного раствора должна соответствовать сигналу, который примерно в 5–20 раз больше уровня шума (лучше брать концентрации в большую сто- рону, нежели в меньшую), или самой маленькой концентрации калибровочного раствора. На основе полученной выборки вычис- ляется стандартное отклонение сигнала (S
y
).
Предел количественного определения
(limit of quantification)
Наименьшее количество вещества в образце, которое можно количественно определить с соответствующей прецизионностью и правильностью.
Предел количественного определения является необходимой валидационной характеристикой методик, используемых для определения низких содержаний веществ в образце, в частно- сти для определения примесей и/или продуктов деградации.
При оценке ПКО используются те же подходы, что и для ПОМ.
При визуальной оценке проводят испытания образцов с раз- личными известными количествами (концентрациями) анализи- руемого вещества и устанавливают минимальное значение, при котором результат анализа может быть оценен визуально с требуемой правильностью и прецизионностью.
Для оценки ПКО по соотношению «сигнал/шум» приемле- мой считается величина отношения 10:1.
17
При оценке ПКО (LOQ) по наклону калибровочной кривой применяется следующая формула (3):
10*
y
S
LOQ
b
(3)
Линейность методики (linearity)
При валидации методики ее линейность в аналитической об- ласти проверяют экспериментально измерением аналитических сигналов для не менее чем 5 проб с различными количествами
или концентрациями определяемого вещества (если проб меньше, то такой подход должен быть обоснован).
В большинстве случаев используют линейные зависимости, отвечающие условию R
XY
≥ 0.99 (R
XY
— коэффициент корреляции
Пирсона), и только при анализе следовых количеств допускается рассматривать линейные зависимости, для которых R
XY
≥ 0.90.
По полученным данным строят график зависимости сигнала от концентрации или от количества определяемого компонента и визуально оценивают его линейность (прикидочное суждение).
Если линейная зависимость наблюдается, то результаты обраба- тывают подходящим статистическим методом, например мето- дом наименьших квадратов.
Аналитическая область методики (range)
Интервал между верхним и нижним значением аналитиче- ских характеристик определяемого компонента в объекте анализа
(его количества, концентрации, активности и т. п.). В этом интер- вале результаты, получаемые с использованием валидируемой методики, должны иметь приемлемый уровень правильности и прецизионности. Диапазон применения методики зависит от ее назначения и определяется при изучении линейности.
Минимально допустимые диапазоны применения методик:
1. Для количественного определения активной субстанции или готового лекарственного препарата: как правило, от 80 % до 120 % от номинального содержания.
2. Для однородности дозирования: от 70 % до 130 % от но- минального содержания, если для испытания не требуется более широкий интервал, обусловленный свойствами лекарственной формы (например, дозированные ингаляторы).
18 3. Для испытаний на растворение: ± 20 % (абсолютных) от нормируемой величины высвобождения. Например, если при контроле высвобождения пролонгированных лекарственных препаратов нормируемая величина высвобождения составляет от 20 % за первый час и до 90 % за 24 ч, то диапазон применения должен быть от 0 % до 110 % от номинального содержания.
4. Для определения примесей: от концентрации, в которой примесь обычно обнаруживается (или от ПКО), до 120 % от нор- мируемого содержания.
Правильность (trueness)
Правильность методики характеризуется отклонением сред- него результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное. Валидируемая методика признается правильной, если значения, принимаемые за истин- ные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике. Правильность должна быть установлена для всего диапазона применения аналитической методики.
Для оценки правильности методик количественного опреде- ления применимы следующие подходы:
1. Анализ с использованием валидируемой методики стан-
дартных образцов или модельных смесей с известным содер- жанием (концентрацией) определяемого вещества.
2. Сравнение результатов, полученных с использованием валидируемой методики и образцовой методики, правильность которой ранее установлена.
3. Использование метода стандартной добавки (внесение в образец известного количества или концентрации вещества).
4. Рассмотрение результатов изучения линейности валидиру- емой методики: если свободный член (интерсепт) в линейной
модели аппроксимации статистически достоверно не отлича-
ется от нуля, то использование такой методики дает резуль-
таты, свободные от систематической ошибки.
Правильность оценивают не менее чем для девяти определений для трех различных концентраций, охватывающих весь диапазон применения, т.е. три концентрации и три повтора для каждой концентрации, при этом должны проводиться все стадии методики.
19
Прецизионность (precision)
Степень близости друг к другу независимых результатов изме- рений, полученных в конкретных регламентированных условиях
(степень рассеивания результатов относительно среднего значения).
Выделяют: повторяемость, промежуточную прецизионность и воспроизводимость.
Повторяемость (сходимость) — характеристика прецизион- ности в условиях минимального варьирования влияющих факто- ров внутри лаборатории (тот же образец, тот же оператор, то же оборудование и реактивы, короткий промежуток времени).
Воспроизводимость — характеристика прецизионности, ис- пользуемая для характеристики рассеяния результатов в условиях межлабораторного эксперимента (тот же образец, разные опера- торы, разное оборудование и реактивы). Повторяемость и вос- производимость являются крайними случаями прецизионности и отвечают минимальной и максимальной вариативности условий эксперимента.
Также выделяют внутрилабораторную воспроизводимость
(промежуточную прецизионность, внутрилабораторную прецизи- онность).
Промежуточная прецизионность подразумевает выполнение серии анализов одного и того же образца, в одной лаборатории при вариации различных факторов: разное время анализа, разные операторы, разные партии реактивов одного и того же вещества, разные приборы и т. п.
Результаты оценки методики анализа по каждому из вариан- тов прецизионности обычно характеризуются соответствующим значением величины стандартного отклонения результата от-
дельного определения.
Обычно при разработке оригинальной методики определяет- ся повторяемость (сходимость) результатов, получаемых с ее ис- пользованием. При необходимости включения разработанной ме- тодики в нормативную документацию дополнительно определя- ется ее внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность.
Межлабораторная прецизионность (воспроизводимость) методи- ки оценивается при предполагаемом ее включении в проект об- щей фармакопейной статьи или в нормативную документацию на фармакопейные стандартные образцы.
20
Устойчивость (robustness)
Способность сохранять найденные для нее в оптимальных
(номинальных) условиях характеристики, приведенные в табли- це, при вероятных небольших отклонениях от этих условий про- ведения анализа.
Устойчивость должна изучаться только в тех случаях, когда валидируемая методика основана на использовании особо чув- ствительных к внешним условиям методов анализа, таких как различные виды хроматографии (ВЭЖХ, ВЭКЭ, ГХ) и функцио- нального анализа. При необходимости оценка устойчивости ме- тодики проводится на стадии ее разработки. Если вероятна невы- сокая устойчивость методики, проверка ее пригодности осу- ществляется в обязательном порядке непосредственно в процессе практического использования.
Примеры типичных изменений:
1. Стабильность растворов, используемых в аналитических методиках.
2. Время экстрагирования.
Для ВЭЖХ:
1. Изменение рН подвижной фазы.
2. Изменение состава и силы подвижной фазы.
3. Разные колонки (разные серии и поставщики).
4. Температура.
5. Скорость потока и т. д.
Для газовой хроматографии:
1. Различные колонки (разные серии и поставщики).
2. Температура термостата.
3. Скорость газа-носителя и т. п.
В ряде случаев для методик, системы или процесса требуется проводить повторную валидацию (ревалидацию). Ревалидация
может быть необходима в следующих случаях (при этом ими не ограничивается):
• изменение схемы синтеза фармацевтической субстанции;
• изменение состава лекарственного препарата;
• изменение аналитической методики.
Повторная валидация не проводится, если производителем представлено соответствующее обоснование. Объем повторной валидации зависит от характера внесенных изменений.
21
ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ
Лабораторная работа 1
1.1. Идентификация ароматических карбоновых кислот
при помощи качественных реакций
Цель работы: установить присутствие ароматической кар- боновой кислоты в испытуемом растворе.
Реактивы: растворы бензойной (c = 500 мг/л), 4-гидрокси- бензойной (c = 500 мг/л), салициловой (c = 500 мг/л) кислот, рас- твор хлорида железа(III) 6-водного (FeCl
3
*6H
2
O; c = 1 г/л), гид- роокись натрия (NaOH; ω = 15 %).
Оборудование: пипетки, пипет-дозаторы, пробирки, штатив для пробирок, пузырьки объемом 10 мл, термометры, термостой- кие химические стаканы, бюксы, мерные колбы на 100 мл, водя- ная баня, электроплитка, шпатели, аналитические весы.
Ход работы
Приготовление растворов ароматических кислот 500 мг/л
Дистиллированная вода предварительно подогревается до ки- пения. На аналитических весах взвешивают 100 мг ароматиче- ской кислоты. Навеску количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл сначала при помощи 5 мл ДМФА и 0.25 мл
NaOH (ω = 15 %), а затем при помощи горячей дистиллированной воды (t = 70–90 o
C). Раствор до метки не доводят. При необходи- мости раствор можно нагреть до растворения осадка на водяной бане или в токе горячей водопроводной воды. Раствор доводят до метки дистиллированной водой, перед этим раствор охлажда- ют до комнатной температуры.
Приготовление раствора
железа (III) 6-водного хлористого 1 г/л
На аналитических весах взвешивают 100 мг FeCl
3
*6H
2
O.
Навеску количественно переносят в мерную колбу вместимостью
100 мл при помощи дистиллированной воды. Объем до метки до- водят дистиллированной водой.