Файл: Методы выделения и очистки биопрепаратов в решении задач биотехнологии..pdf

паратов (например, ферментов). Диализ положен в основу работы аппарата «искусственная почка», который применяется для очищения крови от низкомолекулярных конечных продуктов метаболизма, образующихся в результате жизнедеятельности человека.

Исследуемый материал: раствор яичного белка (белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 20-кратном объеме дистиллированнойводы, фильтруютчерез несколько слоев марли).

Реактивы:

1.Сульфат аммония, насыщенный водный раствор.

2.Хлорид бария, 5%-ный водный раствор.

3.Гидроксид натрия, 10%-ный водный раствор.

4.Сульфат меди, 1%-ный водный раствор.

5.Уксусная кислота, 1%-ный водный раствор.

Оборудование:

1.Целлофан, разрезанный на куски размером 125 × 125 мм.

2.Стакан химический на 1000 мл.

3.Стеклянные палочки.

4.Резиновые колечки.

5.Штатив с пробирками.

6.Пипетки.

Ход работы:

К 5 мл раствора яичного белка добавляют каплю насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Отбирают в две пробирки по 10 капель раствора и проделывают в одной из них биуретовую реакцию (см. лабораторную работу № 2), а в другой – пробу на сульфаты. При проведении пробы на сульфаты в анализируемый раствор добавляют 2 3 капли раствора хлорида бария, появление белого осадка говорит о наличии сульфат-ионов в растворе.

Целлофану, предварительно замоченному в дистиллированной воде, придают форму мешочка, который примерно на 1/3 заполняют исследуемым раствором белка с примесью сульфата аммония. Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, которые прижимают друг к другу с помощью надетых с двух концов резиновых колечек. Мешочек погружают в стакан с дистилли-

10

рованной водой, положив зажимающие его стеклянные палочки на края стакана (см. рисунок). Уровень жидкости в мешочке не должен быть выше уровня жидкости в стакане.

Через час после начала диализа берут две пробы (по 10 капель) наружной жидкости (диализат). С одной из них проводят биуретовую реакцию на белок, а с другой – реакцию на сульфаты, добавляя 2 3 капли хлорида бария. Затем берут две пробы (по 10 капель) жидкости внутри мешочка и также проделывают пробы на белок и сульфаты.

Результаты работы оформляют в виде табл. 2, отмечая знаками «плюс» или «минус» наличие белка и сульфат-ионов в исследованных пробах жидкости.

Таблица 2

Результаты очистки раствора белка от сульфата аммония методом диализа

Контрольные вопросы:

1.На чем основана очистка растворов белков от низкомолекулярных примесей методом диализа?

2.Какие приборы применяются для проведения диализа?

3.Для каких целей применяется диализ в биотехнологии?

Лабораторная работа № 4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ БЕЛКА

Цель работы: овладеть навыками определения изоэлектрической точки белка.

Белок как амфотерный полиэлектролит содержит положительные и отрицательные заряды, соотношение которых определяется

11

количеством остатков кислых и основных аминокислот в его макромолекуле. Заряженность молекулы белка является одним из факторов его устойчивости в растворах, так как препятствует коагуляции белковых молекул и выпадению их в осадок. На общий заряд макромолекулы белка влияет рН среды. Для каждого белка существует значение рН, при котором сумма положительных и отрицательных зарядов его равна нулю. Это состояние белка называется изоэлектрическим, а соответствующее такому состоянию значение рН называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ растворы белков неустойчивы и белки легко выпадают в осадок, особенно в присутствии органических растворителей (этиловый спирт, ацетон и т.д.).

Нахождение ИЭТ для индивидуальных белков позволяет подобрать оптимальные условия для осаждения их из биологических экстрактов, содержащих смесь различных белков. Решение этой задачи имеет важное значение для биотехнологии.

Исследуемый материал: водный раствор казеина (0,1 %) или желатина (0,5 %).

Реактивы:

1.Уксусная кислота, 0,2 М раствор.

2.Ацетат натрия, 0,2 М раствор.

3.Этиловый спирт, 96 %.

Оборудование:

1.Пипетки вместимостью 1 и 2 мл.

2.Штатив с пробирками.

Ход работы:

В шести пронумерованных пробирках готовят буферные рас-

творы с разным значением рН в соответствии с табл. 3. Содержимое пробирок перемешивают и в каждую добавляют по 0,5 мл исследуемого раствора белка.

После этого смесь в пробирках снова встряхивают и отмечают помутнение раствора. В каждую пробирку добавляют по 2 мл этилового спирта и оценивают степень мутности проб.

12

Результаты работы оформляют в виде табл. 4, отмечая степень мутности раствора до и после добавления этилового спирта по пятибалльной шкале: 1 отсутствие помутнения, 2 слабое, 3 умеренное, 4 сильное, 5 очень сильное помутнение.

За величину ИЭТ принимают значение рН, при котором наблюдается наибольшая степень мутности пробы.

В выводе записать величину ИЭТ исследуемого белка и отметить возможность практического использования полученной в ходе опыта информации для выделения этого белка.

Контрольные вопросы:

1.Что такое изоэлектрическая точка белка?

2.Каким образом определяют изоэлектрическую точку белка?

3.Для каких целей можно использовать информацию о величине изоэлектрической точки белка?

13

Лабораторная работа № 5 РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ

ХРОМАТОГРАФИИ

Цель работы: овладеть навыками разделения смеси липидов методом тонкослойной хроматографии.

Разделение липидов методом тонкослойной хроматографии основано на различной скорости перемещения липидных фракций (фосфолипиды, свободные жирные кислоты, холестерин, триацилглицериды) в тонком слое адсорбента (неподвижная фаза) при движении через него органического растворителя (элюент, подвижная фаза). Скорость разделения фракций зависит от их относительной полярности. Для обнаружения липидных фракций на хроматограмме проводят ее обработку парами йода.

Исследуемый материал: сыворотка или плазма крови.

Реактивы:

1.Смесь этанол – диэтиловый эфир (3:1).

2.Хлороформ.

3.Растворитель для хроматографии: н-гексан – диэтиловый эфир – уксусная кислота (73:25:2).

4.Йод кристаллический.

Оборудование:

1.Пластинки хроматографические «Силуфол УФ254» или аналогичные.

2.Камера для хроматографии.

3.Водяная баня.

4.Мерная колба на 25 мл.

5.Чашка фарфоровая для выпаривания.

6.Пипетка на 10 мкл.

7.Камера для проявления хроматограмм.

8.Хроматоскоп.

Ход работы:

В мерной колбе на 25 мл смешивают 1 мл исследуемой сыворотки крови с 10 мл приготовленной спиртово-эфирной смеси. Колбу с содержимым помещают на 30 с в кипящую водяную баню,

14

охлаждают под струей холодной воды и доводят объем спиртовоэфирной смесью до 25 мл. Полученный липидный экстракт отфильтровывают через обезжиренный бумажный фильтр в фарфоровую чашку, выпаривают досуха на кипящей водяной бане, а осадок растворяют в 0,2 мл хлороформа.

В хроматографическую камеру наливают растворитель для хроматографии. Пипеткой наносят на хроматографическую пластинку, отступая 1 см от края, 10 мкл хлороформного экстракта, помещают пластинку в камеру этим концом вниз, погрузив его на 3 5 мм в растворитель. Камеру закрывают крышкой для поддержания равномерной концентрации паров. Хроматографию проводят при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не приблизится к верхнему краю пластинки, не доходядо него0,5 см.

Пластинку извлекают из камеры, высушивают на воздухе и вносят в камеру для проявления, на дно которой предварительно насыпают кристаллы йода. Камеру закрывают и подогревают на водяной бане при 60 °С. Возгоняющийся йод вступает в реакцию с липидными фракциями.

Через 1 мин пластинку извлекают и просматривают в ультрафиолетовом свете на хроматоскопе. Фракции липидов обнаруживают в виде коричневых пятен. Ближе к линии старта расположены фосфолипиды, затем холестерин, моноацилглицериды, диацилглицериды, свободные жирные кислоты, триацилглицериды и эфиры холестерина.

Зарисуйте полученную хроматограмму, указав на ней соответствующие липидные фракции сыворотки крови. Напишите формулы представителей каждой липидной фракции в порядке убывания их относительной полярности.

Контрольные вопросы:

1.Что такое хроматография?

2.Какие виды хроматографии используются для очистки и анализа биопрепаратов?

3.От чего зависит скорость перемещения липидов в слое сорбента при проведении тонкослойной хроматографии?

15

Лабораторная работа № 6 ЭКСТРАКЦИЯ АЛКАЛОИДОВ ИЗ ЧАЙНОГО ЛИСТА И КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА АЛКАЛОИДЫ

Цель работы: овладеть навыками выделения алкалоидов из чайного листа и провести их качественное определение с помощью общеалкалоидных осадительных реактивов и специфической мурексиновой пробы на пуриновые алкалоиды.

Алкалоиды из биологического сырья экстрагируют водными растворами кислот (обычно 5%-ной HCl или 5%-ной CH3COOH) при кипячении в течение нескольких минут.

Для идентификации алкалоидов в различных объектах очень широко используют осадительные общеалкалоидные реактивы. Известно около сотни таких реактивов, которые образуют с алка- лоидами-основаниями нерастворимые в воде простые или комплексные соли. В данной работе используются реактив Бушарда– Вагнера, раствор танина и раствор пикриновой кислоты. Осадительные реакции нередко используют для испытания подлинности препаратов алкалоидов. При выполнении этих реакций выпадают аморфные или кристаллические осадки. Последние часто имеют характерную температуру плавления, которая также может быть использована для идентификации алкалоида. Осадительные реактивы неспецифичны для алкалоидов. Они дают положительные реакции не только с алкалоидами, но и с большинством азотсодержащих органических соединений, в том числе с белками.

Для испытания подлинности пуриновых алкалоидов (кофеин, теофиллин, теобромин) используется мурексидная проба. Она основана на разрушении молекулы пурина при нагревании с окислителем (перекисью водорода, бромной водой, азотной кислотой и др.) и образовании смеси производных аллоксана и его изомера диалуровой кислоты. Взаимодействуя между собой, они образуют метилированные производные аллоксантина, которые под действием избытка раствора аммиака приобретают пурпурно-красную окраску, что обусловлено появлением аммонийной соли метилированного производ-

16