Файл: Метод проточной цитофлуориметрии.docx

Реферат

На тему: «Метод проточной цитофлуориметрии»

Оглавление

Введение

Проточная цитофлуориметрия или Flow cytometry – функциональный метод диагностики, позволяющий разносторонне анализировать различные популяции клеток, в том числе каждую клетку в отдельности. Проточная цитофлуориметрия – метод регистрации оптических параметров находящихся в потоке клеток или частиц по сигналам светорассеяния и флуоресценции в режиме поштучного анализа [1, 2].

Метод разработан в середине 20 века, на сегодняшний день его используют как ученые, так и врачи-клиницисты, поскольку он является наименее трудоемким, дающим быстрый и информативный результат [1, 6].

Актуальность работы. В сравнении с молекулярными методами диагностики, проточная цитометрия обладает явными преимуществами, а именно возможностью быстрой оценки большого количества параметров при относительной экономичности исследования. Многообразие реагентов и технологических решений (от самых простых клеточных анализаторов до проточных цитометров и цитометров с визуализацией) позволили значительно расширить как прикладные, так и диагностические возможности проточной цитометрии, делая ее одним из мощнейших методов клеточного анализа [1, 7].

Таким образом, цель работы: рассмотреть и проанализировать метод проточной цитофлуориметрии путем изучения современной научной литературы за последние пять лет, в том числе интернет-изданий, по исследуемой теме.

Задачи:

• 
  Ознакомится с устройством и принципом работы проточного цитофлуориметра;
  
• 
  Рассмотреть практическое применение метода проточной цитофлуориметрии в современной клеточной диагностике;
  
• 
  Рассмотреть основные правила и контрольные измерения необходимые для предотвращения ложных результатов исследования.
  

1. 
   Устройство и принцип работы проточного цитофлуориметра
   

---

Проточная цитофлуориметрия – информативный метод одновременных количественных измерений, основанный на анализе параметров светорассеяния и интенсивности флуоресценции каждой индивидуальной клетки в суспензии. Метод включает: подготовку образцов, их обработку и окрашивание, настройку и использование прибора, сбор, анализ и хранение данных, а также соответствующие меры контроля качества.

Суспензия предварительно окрашенных флуоресцирующими красителями (моноклональные антитела, конъюгированные с флуоресцентными метками) клеток, при выполнении исследования, через наконечник специальной конструкции под давлением впрыскивается в центр быстро движущегося в том же направлении потока жидкости [1, 7, 9, 10].

Подхваченные потоком жидкости клетки, согласно принципу гидродинамического фокусирования, когда возникают условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обтекающей их жидкостью, выстраиваются друг за другом. Измерения происходят при пересечении клеткой сфокусированного лазерного луча и световые сигналы, получаемые при взаимодействии луча лазера с клетками, регистрируются системой детектирования и преобразуются в элементы данных, которые можно анализировать и объединять с данными, полученными для других клеток в составе того же образца [9, 10].

Проточная цитометрия позволяет проводить анализ морфологических/фенотипических, функциональных свойств клеток и клеточно-подобных структур (изолированных ядер, хромосом и т.п.), а также получать данные о количественном содержании и функциональной активности ДНК и РНК, экспрессии секретируемых и внутриклеточных белков, об изменении уровня рН и др. [3, 4].

Современные проточные цитофлуориметры представляют собой довольно сложные устройства, требующие от оператора хорошего знания как биологии, так и ряда физических дисциплин, в первую очередь оптики и гидродинамики. Высокая производительность приборов позволяет собирать и анализировать большие массивы данных, объединяющие информацию о десятках и сотнях тысяч клеток, при этом для каждой клетки, в зависимости от конструкции прибора, может измеряться от 5 до 14 и более параметров. Анализ собранных данных позволяет выделить популяции клеток, обладающие теми или иными свойствами, определить их относительное и абсолютное содержание в образце [1, 4, 5,].

---

Таким образом, проточный цитофлуориметр – это прибор, измеряющий оптические свойства индивидуальных клеток в суспензии.

Проточный цитометр состоит из трех основных блоков: жидкостного, оптического и блока обработки электронного сигнала (рис. 1). Измерение оптических свойств клетки осуществляется в проточной ячейке – ключевом элементе цитофлуориметра [1, 5, 9].



Рисунок 1. Компоненты обобщенного проточного цитометра, включающего пять параметров – 2 детектора светорассеяния (SSC и FSC) и 3 детектора сигналов флуоресценции (FL-1,2,3)

Далее, рассмотрим устройство и основные параметры проточного цитометра «MACSQuant» производства Miltenyi Biotec [8].

Анализатор MACSQuant представляет собой компактный настольный проточный цитометр, который можно легко установить в небольшой лаборатории с ограниченным пространством, например в комнате с ламинарным шкафом [8, 10].

Отличительные черты прибора MACSQuant: 10 оптических каналов; мощное программное обеспечение; возможность анализа редких клеточных субпопуляций (технология магнитной сепарации); анализ большого количества образцов (возможность использования 96-луночного планшета); абсолютный подсчет количества клеток [8].

Оптические параметры прибора представлены таблице 1.

Таблица 1

Оптические параметры проточного цитометра MACSQuant

Длина волны возбуждения (нм)	Оптический канал	Используется для детекции флуорохромов:
405 (фиолетовый)	голубой	VioBlue™/Hoechst/ Pacific Blue
	желто-зеленый	Pacific Orange
488 (голубой)	Зеленый	FITC/GFP
	Желтый	PE
	Красный	PI/PE-Cy5.5/PerCP
	Инфракрасный	PE-Cy7
635 (красный)	Красный	APC
	Инфракрасный	APC-Cy7
488 (голубой)	SSC/FSC	Прямое и боковое светорассеяние

---

Прибор MACSQuant оснащен такими функциями как автоматический забор образца из пробы и анализ клеточных субпопуляций; возможность разработки индивидуального протокола исследования; персонифицированные учетные записи пользователей, настройки и шаблоны [8, 9].

Результаты исследования представлены в удобном для пользователя формате: в виде выбранного пользователем шаблона; вновь созданных окон с графиками; в виде выбранного цитометром шаблона, применяемого автоматически при использовании реагентов MACS Reagents.

Проточный цитометр регистрирует два канала светорассеяния и 8 флуоресцентных каналов, проводить чувствительный фенотипический анализ популяции клеток, используя три лазера. В комбинации с интегрированным модулем обогащения клеток (MACS Cell Enrichment Unit), анализатор позволяет проводит достоверный анализ редких клеточных субпопуляций. Например, пробу можно предварительно обогатить антигенспецифичными Т-клетками, циркулирующими опухолевыми клетками, эндотелиальными клетками или стволовыми клетками-предшественниками перед проведением детальной фенотипической характеристикой образца [8, 9].

Протоколы для анализа проб управляются при помощи программного обеспечения анализатора MACSQuant. Трудоемкие и затратные по времени процедуры уже предусмотрены в списке задач, которые может выполнять сам инструмент. Устройство обеспечивает плавный переход от пипетирования проб, до генерации результатов в готовом виде для представления.

При использовании фирменных микрочастиц для калибровки (MACSQuant Calibration Beads), каналы флуоресценции и светорассеяния могут быть откалиброваны в автоматическом режиме.

Визуальная индикация уровней рабочих жидкостей и состояния инструмента позволяет наблюдать за его состоянием даже с другого конца лаборатории.

Результаты, настройки инструмента и программного обеспечения можно автоматически архивировать на другой компьютер сети или записать на DVD-диск. Данные можно сделать доступными или закрытыми для других пользователей, в зависимости от настроек профиля пользователя. Программное обеспечение совместимо с форматом FSC. Данные из архива можно просмотреть из реестра библиотеки [8].

2. 
   Применение метода проточной цитофлуориметрии в современной клеточной диагностике
   

---

Спектр областей применения проточной цитофлуориметрии охватывает клеточную и молекулярную биологию, микробиологию, ботанику, иммунологию, эмбриологию, генетику и т.д. [4].

В практической медицине проточная цитофлуориметрия используется в гематологии, бактериологии, вирусологии, онкологии, медицинской иммунологии, причем данный список постоянно расширяется [9].

Применение проточной цитофлуориметрии [7]:

• 
  Подсчет клеток и оценка их жизнеспособности. Используют классические красители на жизнеспособность (например, наборы LIVE/DEAD kit от Thermo Fisher Scientific или Muse® Count and Viability Kit), которые позволяют отличить мертвые клетки или клетки с нарушенной целостностью клеточной мембраны от живых клеток.
  
• 
  Анализ клеточного цикла. Различные стадии клеточного цикла отличаются по содержанию ДНК в клетке. Наборы для анализа клеточного цикла содержат ДНК-связывающие красители, интенсивность флуоресценции которых пропорциональна количеству ДНК. С помощью гистограммы интенсивности флуоресценции можно выделить клетки в G0/G1, S и G2/M фазах клеточного цикла.
  
• 
  Анализ апоптоза. Основан на связывании Аннексина V с фосфотидилсерином на поверхности апоптотирующих клеток. На ранних стадиях апоптоза молекулы фосфотидилсерина перемещаются на внешнюю сторону клеточной мембраны и способны связываться с Аннексином V. На поздних стадиях апоптоза клетки теряют целостность клеточной мембраны и поглощают краситель, который иначе не смог бы проникнуть через клеточную мембрану. Для анализа различных стадий апоптоза проводят определение активированных каспаз в сочетании с красителем, окрашивающим мертвые клетки (рис. 2).
  

Рисунок 2. Анализ различных стадий апоптоза

• 
  Иммунофенотипирование клеток крови. Происходит идентификация внутриклеточных белков, оценка степени цитотоксичности и др.. Производится измерение антигенов кластера дифференцировки на поверхности тысяч отдельных клеток, характеристика размеров субпопуляции (например, подтипов лейкоцитов) путем мечения клеток конъюгированными с флуорохромом моноклональными антителами.
  
• 
  Клиническая лабораторная диагностика (табл. 2). Проточные цитометры, зарегистрированные Росздравнадзором, в лабораторной диагностике активно применяются: для оценки иммунного статуса пациента (используют такие поверхностные маркеры, как CD3, CD4, CD8, CD 19, CD 20, CD22 и т.д.); оценки иммунологического фенотипа нормальных и опухолевых клеток для своевременной постановки диагноза; для отслеживания острых лейкозов в ходе лечения; для диагностики гемобластозов.
  

---