Файл: Метод проточной цитофлуориметрии.docx

Таблица 2

Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике

№ п/п	Область применения	Краткое описание
1	Исследования субпопуляционного состава лимфоцитов (Скрининг)	Определение относительного и абсолютного содержания лимфоцитов периферической крови с использованием комбинирования панлейкоцитарного маркера (CD45) и маркеров фракций лимфоцитов: Т-, В- и NK (CD3, CD19, CD16+, CD56), а также основных субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4, CD8)
2	Исследования при иммунодефицитных состояниях	Существует ряд исследований незаменимых для диагностики и мониторинга терапии иммунодефицитов (общая вариабельная иммунная недостаточность, IPEX-синдром, Синдром Вискот-Олдридж и др.), а также ряда других заболеваний, связанных с патологией иммунитета
3	Исследования при аутоиммунных заболеваниях	Определение экспрессии HLA-B-27. Оценка содержания наивных В-клеток и В-клеток памяти с использованием моноклональных антител CD19, CD5, CD27. Исследование содержания регуляторных Т-клеток (CD3+, CD4+, CD25+, CD127-)
4	Мониторинг ВИЧ	Оценка абсолютного содержания субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови на момент постановки диагноза и оптимизация проводимой терапии
5	Исследование при заболеваниях, связанных с патологией тромбоцитов. Мониторинг антитромбоцитарных агентов	Иммунофенотипический анализ функционального состояния тромбоцитов (оценка экспрессии маркера активации тромбоцитов CD62P и др.)
6	Исследования при аллергических заболеваниях	Исследование экспрессии CD203c на базофилах (экспрессирующих CRTH-2)
7	Мониторинг терапии септических осложнений	Оценка экспрессии CD64 и CD163 гранулоцитами и HLA-DR моноцитами периферической крови
8	Мониторинг антивирусной терапии	Выявление о подсчет антиген-специфических СВ8+ Т-клеток с использованием технологии тетрамеров
9	Диагностика онкогематологических заболеваний	Определение линейной принадлежности трансформированных клеток, анализ степени дифференцировки опухолевых клеток с использованием специфических моноклональных антител. Оценка эффективности химиотерапии – определение минимальной резидуальной болезни

---

3. 
   Основные правила и контрольные измерения метода проточной цитофлуориметрии
   

Прежде чем приступать к измерениям, необходимо проверить и отладить работу проточного цитофлуориметра. Пренебрежение основными правилами и необходимыми контрольными измерениями может привести к получению ложных результатов исследования [9].

Существуют явления, которые могут повлиять на правдивость полученных данных и привести исследователей к ложноположительным или ложноотрицательным результатам, а именно аутофлуоресценция и неспецифическое связывание антител [7,9].

Некоторые клетки обладают собственной флуоресценцией (аутофлуоресценцией). Перед проведением любых экспериментов обязательно необходимо проверить как выглядит проба, обработанная полностью в соответствии с планируемым протоколом, но в которую не были добавлены красители. Если видна аутофлуоресценция, необходимо принимать за ноль именно ее [1, 7, 9].

Антитела могут не только распознавать целевой белок, но и неспецифически связываться с чем-то еще. Уберечься от ошибок можно с помощью изотипических контролей – антител, содержащих такую же Fc-часть, что и целевое антитело, окрашенных той же меткой, но при этом не специфичных к целевому белку [9].

Для настройки чувствительности прибора к флуоресценции необходимо использовать соответствующие изотипические контроли или образцы, окрашенные по отдельности каждым антителом, калибровочные микросферы, а также не забывать проверять аутофлуоресценцию образцов перед началом работы [1, 9, 10].

Для определения области измерений, а также для проверки корректной работы прибора необходимо использовать отрицательные и положительные контроли. Например, для оценки количества апоптотических клеток в пробе потребуется отрицательный контроль, в котором абсолютное большинство клеток живые. Также пригодится положительный контроль, где большая часть клеток находится в апоптозе под действием любого известного апоптогенного агента. Таким образом можно определить область измерения, чтобы детектировать значимые изменения [1, 7].

Данную часть работы можно сделать и после измерения всех проб, поскольку программное обеспечение всех цитометров позволяет анализировать данные после эксперимента. Главное – сделать пробы с правильными положительными и отрицательными контролями, чтобы было с чем сравнивать [1, 7].

---

С методом проточной цитометрии наиболее часто связывают следующие трудности: повышенная флуоресценция или бокового светорассеяния, аномальное количество регистрируемых событий, высокая интенсивность флюоресценции и слабая интенсивность флуоресценции.

Высокая интенсивность флуоресценции может быть обусловлена чрезмерным мечением антител, ненадлежащей или недостаточной промывкой клеток или ненадлежащим блокированием.

Слабую интенсивность флуоресценции может обуславливать множество факторов: параметры приборов, например, плохое лазерное выравнивание, неверная поправка, неправильная настройка, неподходящий коэффициент усиления и низкая выходная мощность лазера могут отрицательным образом сказываться на интенсивности флуоресценции. Помимо этого, вопросы, связанные с клеточной физиологией или подготовкой реагентов, например, недостаточная концентрация антител, лабильный или секретируемый антиген-мишень, реагенты низкого качества или неправильное их хранение (что обуславливает выцветание флуорохромов) также могут приводить к снижению сигнала [1].

Список литературы

1. 
   Балалаева И.В. Проточная цитофлуориметрия. / Учебно-методическое пособие // Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2014. – 75 с.
   
2. 
   Гальцева И.В., Давыдова Ю.О. и др. Роль и место проточной цитометрии в диагностике и мониторинге минимальной остаточной болезни при множественной миеломе. // Онкогематология № 2. – 2017. – С. 80-94.
   
3. 
   Демина И.А., Семченкова А.А. и др. Измерение абсолютной длины теломер методом проточной цитометрии. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии Т. 17, № 4. – 2018. – С. 66-72.
   
4. 
   Зурочка А.В., Хайдуков С.В. и др. Проточная цитометрия в медицине и биологии. // Екатеринбург: РИО УрО РАН. – 2014. – 552 с.
   
5. 
   Трусов Г.А., Чапленко А.А. и др. Применение проточной цитометрии для оценки качества биомедицинских клеточных продуктов. // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение Т.18, № 1. – 2018. – С. 16-24.
   
6. 
   Якунина Е.Ю., Мошева А.В. и др. Проточная цитофлуориметрия как современный метод анализа клеточного осадка мочи. // Сибирское медицинское обозрение № 5. – 2016. – С. 111-112.
   
7. 
   Проточная цитометрия: принципы метода и практическое применение [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://helicon.ru/support/methodological/protochnaya-tsitometriya-printsipy-metoda-i-prakticheskoe-primenenie/ (дата обращения 03.04.2019)
   
8. 
   Проточный цитометр MACSQuant [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.ld.ru/suppliers/miltenyi-biotec.html (дата обращения 03.04.2019)
   
9. 
   Проточная цитофлуориметрия [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://biomolecula.ru/articles/12-metodov-v-kartinkakh-protochnaia-tsitofluorimetriia (дата обращения 03.04.2019)
   
10. 
    Introduction to Flow Cytometry [Электронный ресурс]. – Электрон. текстовые дан. – Becton, Dickinson and Company, 2014. Режим доступа: http://www.bdbiosciences.com/eu/services/training/itf_launch.jsp, свободный.
    

---

---