Файл: Протеомика к первой картике Главные протеомные вехи. 1950 г.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 04.02.2024
Просмотров: 27
Скачиваний: 0
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Протеомика
К первой картике:
Главные протеомные вехи. 1950 г. — Группа шведа Пера Эдмана предложила химический метод секвенирования пептидов. 1951–1955 гг. — Под началом британца Фредерика Сэнгера определили структуру короткого белка инсулина и доказали, что отдельные белки не аморфны в плане состава, а обладают постоянной последовательностью аминокислотных остатков. 1959 г. — Американцы Розалин Ялоу и Соломон Берсон создали первый иммуноанализ, в том числе для определения белков. 1967 г. — Создали первый автоматический белковый секвенатор, работающий по методу Эдмана. 1970 г. — Швейцарец Ульрихом Лэммли предложил оптимальный метод гель-электрофореза белков в денатурирующих условиях — с использованием додецилсульфата натрия. 1975 г. — Американец Патрик О’Фарелл и немец Йоахим Клозе независимо изобрели 2D-электрофорез белков и получили первые протеомные карты. 1984 г. — Под руководством американца Джона Фенна разработали ионизацию молекул электрораспылением. Впоследствии она позволила осуществлять масс-спектрометрию макромолекул, включая белки, без их разрушения. 1985 г. — Коичи Танака из Японии предложил мягкую ионизацию макромолекул лазером для масс-спектрометрии. Немцы Франц Гилленкамп и Михаэль Карас применили сходный метод для белков и пептидов. Возник метод ионизации MALDI. 1993-1996 гг. — Несколько групп исследователей предложили идентифицировать белки при помощи масс-спектрометрии фрагментов протеолиза и поиска по предсказанной из генома последовательности. Возникла масс-спектрометрическая пептидная карта (пептидный фингерпринт, или дактилоскопия). 1994 г. — Термин «протеом» как белковое дополнение к геному ввел австралийский аспирант Марк Уилкинс. 1994–1999 гг. — Появились первые поисковые программы для идентификации белков масс-спектрометрией по геномным последовальностям. Протеомика стала доступна широкому кругу пользователей. 1999–2001 гг. — Скорострельная (shotgun) протеомика. Несколько научных групп предложили применять для идентификации смеси пептидов совмещение высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии. Использовали ионизацию электрораспылением.
2000–2005 гг. — Российский физик Александр Макаров, работающий за рубежом, изобрел ионную ловушку нового типа — Orbitrap. Приборы на основе Orbitrap ввели в эксплуатацию. Масс-спектрометрия высокого разрешения демократизировалась и начала широко использоваться в протеомике. 2005 г. — Американцы Кристи Хантер и Ли Андерсон продемонстрировали использование масс-спектрометрического метода мониторинга множественных реакций (MRM) для количественного анализа природных пептидов. Возникла направленная (таргетная) протеомика. 2007 г. — Под руководством американца Стивена Гиги предложили новый метод оценки уровня ложноположительных результатов скорострельной протеомики с использованием «фальшивых» последовательностей (анализ target-decoy). 2012–2014 гг. — Скорострельная протеомика достигла уровня идентификации около 10 тысяч белков человека в одном образце — примерно половины кодируемых в геноме. Под руководством немца Бернхарда Кустера и американца Ахилеша Пандея независимо были опубликованы работы, декларирующие черновые версии полного протеома человека.
Ко второй картинке:
Ферментативная активность — первые знания о белках
Идентификация некоторого соединения — это установление его структуры, в случае полипептида — полное или частичное определение его последовательности, иными словами, секвенирование. Следующей стадией будет не только идентификация (то есть, качественный анализ белка), но и определение его концентрации — количественный анализ. Интересно, что понятие об определении активности белка развилось еще до того, как установили его химическую природу. Примерно говоря, ферментативная активность свежего мясного фарша (то есть, гомогенизированной мышцы млекопитающего) могла быть установлена простыми спектрофотометрическими методами еще в начале XX века (рис. 2), когда химическая основа жизни оставалась неизвестной. Однако белковый катализатор, осуществляющий эту реакцию, можно было оценить количественно в условных единицах активности. И до сих пор в клинике многие биомаркеры определяют в таких условных единицах — например, аланиниаминотрансферазу и аспартатаминотрансферазу , несмотря на то, что современная техника способна определить их абсолютное количество. В случае многих ферментов определение активности и удобно, и правильно, поскольку часть молекул может не работать вследствие инактивации, при этом присутствуя в образцах.
К третьей картинке:
Выделение чистых белков и секвенирование по Эдману
Тем не менее к 1970-м годам биохимиков перестала удовлетворять работа вслепую, например, измерение активности ферментов и других соединений без представлений об их химической структуре. Появились способы очистки белков, которые сочетали принципы хроматографии, электрофореза, центрифугирования, некоторые из которых исчезли из обращения, а другие используют до сих пор. Отдельной задачей было подтвердить чистоту соединений во фракциях после очистки. Для этого использовали спектральные методы (от простых до сложных), а также визуализацию окрашенных полос при электрофорезе. Получение из биоматериала выделенного хотя бы до 90% чистоты белка без использования антител и других специфических связующих веществ и тогда, и сейчас — длительный трудоемкий процесс. 1970–1980-е годы — золотой век развития методов разделения белков, когда заливали огромные гели для электрофореза, конструировали метровые колонки для ручной и автоматической хроматографии.
Если вам повезло, то после нескольких месяцев или лет кропотливой работы вы убедились, что в пробирке или в геле находится ваш «товар» — белок, функцию которого вы изучаете. Какие варианты его идентификации у вас есть, если вы пока в веке двадцатом? Во-первых, если у вас есть гипотеза по поводу того, что в вашей пробирке, вы можете использовать известные антитела, если они есть в продаже или любезно предоставлены владельцами. Конечно, если сегодня доступны антитела разных видов к большинству белков человека и модельных животных, в то время их ассортимент был гораздо более скромным. Поэтому шанс на окраску интересующей вас молекулы антителами очень мал. Но не отчаивайтесь! Еще в 1950-е годы шведский химик Пер Эдман разработал метод секвенирования пептидов (рис. 3).
Рисунок 3. Секвенирование белков по Эдману. Если обработать пептид изотиоцианатом фенила (ФИТЦ), электрофильный атом углерода на изотиоцианатном радикале при умеренном подщелачивании взаимодействует с нуклеофильным азотом незаряженной аминогруппы. В итоге на N-конце пептида образуется фенилтиокарбомоильный радикал. Если умеренно закислить реакционную смесь, он отщепляется, увлекая с собой N-концевую аминокислоту, с образованием тиазолинона со специфичным радикалом, характеризующим эту аминокислоту. При этом остальная часть аминокислотной цепи остается неизмененной. Особое производное, которое будет отличаться по присущему аминокислоте радикалу, еще раз преобразуют в кислых условиях — для стабилизации — и анализируют хроматографически. Так можно отличить такие производные для всех аминокислот, поскольку из-за характерного радикала они будут характеризоваться своим временем выхода с обращенной фазы
[3]. Если белок или пептид, который мы анализируем, присоединен к твердофазному носителю, производное N-концевой аминокислоты можно смыть и анализировать отдельно, а цикл анализа повторить, выстраивая таким образом аминокислотную последовательность.
Метод Эдмана был по тем временам очень прогрессивен. Он с высокой точностью предоставлял последовательность до 30 аминокислотных остатков. Характеризовался достаточно высокой чувствительностью, будучи способным секвенировать пептиды в количестве менее 0,1 нмоль с 99% точностью. Более того, в конце 1960-х его автоматизировали в виде пептидного секвенатора, где робот-раскапыватель поочередно снимал N-концевые производные с полипептидов, закрепленных на специальной бумаге, направляя их затем в хроматограф. Но исследователям опять хотелось большего — их не устраивала необходимость в очистке пептидов и белков перед секвенированием, а также некоторые другие ограничения эдмановского метода, в частности, его неспособность секвенировать продукты с модифицированным N-концом.
Небольшой интерес к методу Эдмана существует до сих пор, в особенности, для белков и пептидов тех организмов, последовательность которых нельзя предсказать из данных секвенирования нуклеиновых кислот [6]. В этом методе реализуется прямой анализ, где ошибки связаны с технической погрешностью. Последовавшие за ним способы анализа аминокислотной последовательности содержат элементы предсказания, поэтому к техническим ошибкам в них прибавляются алгоритмические.
К четвертой картинке:
Двумерный электрофорез — первая карта протеома
В 1970 году в электрофорезе белков произошла методическая революция — швейцарец Ульрих Лэммли предложил оптимальный метод гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Белки жестко денатурировали амфифильным веществом, вроде мыла — додецилсульфатом натрия, — за счет чего каждая молекула покрывалась слоем из этого детергента. Суммарный отрицательный заряд такого комплекса оказывался примерно пропорционален молекулярной массе белка. Это позволяло делить белки в полиакриламидном геле хотя и с помощью электрического поля, но по молекулярной массе. По справедливости отметим, что Лэммли не изобрел метод de novo, а лишь оптимизировал его по существующим в литературе предпосылкам. За это, кстати, его работа сейчас входит в пятерку самых цитируемых в мире научных статей
[7]. Разработки в этой области публиковали и ранее, в том числе в 1967 г. американец Арнольд Шапиро с соавторами [8].
Хорошо принятый метод Лэммли стал совершенствоваться и комбинироваться с другими видами разделения белков. В 1975 году американец Патрик О’Фарелл и немец Йоахим Клозе независимо предложили комбинировать денатурирующий электрофорез в геле с предварительной электрофокусировкой белков. Фокусировку проводят в относительно тонкой, толщиной с гель (1–2 мм) стеклянной трубке [9]. Трубку заполняют гелем со специальными полимерами — амфолинами, — которые способны создавать в ней неподвижный градиент рН. Таким образом, при движении в электрическом поле нанесенные в эту трубку белки останавливаются в участке, где амфолинами был достигнут рН, равный изоэлектрической точке молекулы белка. Гель в виде тонкого тяжа выдавливают из трубки и приплавляют к готовой гелевой пластине для обычного денатурирующего фореза по Лэммли, после чего проводят разделение в другом направлении. Белки, вначале распределенные по изоэлектрической точке, теперь движутся в зависимости от их молекулярной массы. Полученный метод справедливо называется двумерным (2D) электрофорезом (рис. 4). Как можно предполагать, каждый белок на итоговой пластине геля после окраски выглядит не как полоса (в отличие от обычного денатурирующего геля), а как сфокусированное, округлое пятно. Таким образом, О’Фарелл и Клозе впервые показали белковую карту, где каждое пятно на большой пластине геля (до 40×40 см) представляет одну изоформу белка, а его размер и интенсивность — более или менее пропорциональны его концентрации.
Рисунок 4. Схема двумерного электрофореза белков и реальная электрофореграмма, окрашенная флуоресцентным красителем.
рисунок Ольги Пташник
Искусные руки биохимиков прошлого многократно усовершенствовали метод двумерного электрофореза, который был ведущим в анализе белков до середины 2000-х годов. Вместо заливки трубок амфолины размещали на готовых полосках. Были предложены разные устройства для приготовления гелевых пластин, разных модификаций процесса электрофореза, причем для разных размеров и толщины геля в зависимости от задачи исследования. По чувствительности совершенствовали красители, в том числе, флуоресцентные. Более того, на волне популярности двумерных гелей, некоторые процессы их приготовления и окраски автоматизировали. Поскольку характеристики окрашенных пятен