Файл: Протеомика к первой картике Главные протеомные вехи. 1950 г.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 04.02.2024
Просмотров: 29
Скачиваний: 0
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
косвенно связаны с количеством белка в пробе, привлекательно сравнивать изображения гелей, полученные из одних и тех же образцов в различных условиях. Процесс обработки изображений гелей также автоматизировали, причем появилось много конкурирующих компьютерных программ, осуществляющих обработку и сравнение сканов двумерных гелей.
В зависимости от интервала концентраций находящихся в биоматериале белков, число отдельных пятен на двумерных гелях достигало 5 тысяч. С сегодняшней точки зрения очевидно, что это не означает, что на геле визуализированы продукты 5 тысяч генов. Изоформы одного генного продукта, которые отличаются по последовательности за счет гетерозиготности или протеолиза или по более тонкой структуре за счет модификаций остатков, будут, как правило, отражаться в виде отдельных пятен. Например, отщепление одного остатка аргинина от небольшого белка альфа-амилоида так существенно меняло изоэлектрическую точку, что на геле пятно перемещалось примерно на 10 см [10].
Тем не менее двумерная электрофореграмма с визуализированными тысячами белков может считаться первым протеомом — то есть, первым видом анализа, в котором определяется всё множество белков, присутствующих в биологическом образце, или существенная их доля
«Звездное небо» двумерного электрофореза — первый и последний способ увидеть протеом воочию. Более того, при качественной постановке методики человеческого глаза вполне хватает, чтобы обнаружить отличия между похожими пластинами с гелем. Последующие методы протеомики, рассказ о которых впереди, образуют «большие данные», невидимые, как божество. Это обстоятельство во многом сохраняет популярность «двумерника», который используют по сей день, хотя и не так часто, как раньше. Тем не менее в продаже до сих пор имеется оборудование и программное обеспечение для полного цикла выполнения этой методики.
По личным впечатлениям, двумерный электрофорез белков — одна из самых трудоемких и сложных для выполнения биохимических процедур, в которой используются десятки стадий, реагентов и несколько типов лабораторного оборудования. В лаборатории мы в шутку называли тех, кто ставит двумерный электрофорез, «протеомными художниками». И действительно, постановка метода длится два—три дня и требует существенной концентрации на всех ее этапах. Малейшая оплошность приводит к существенному искажению «картины» на геле. Метод не автоматизируется целиком, что и было одной из причин снижения его популярности. Однако он получил второе дыхание уже на рубеже веков, когда в науку ворвался полный геном, а в протеомику вслед за ним —
масс-спектрометрия.
К пятой картинке:
Ранние работы по прямому анализу компонентов крови для диагностики заболеваний, в особенности, злокачественных опухолей, не привели к впечатляющим результатам. Однако, судя по последним открытиям в биологии рака, под сомнением оказалась сама возможность эффективного использования биохимических маркеров для его первичной, ранней диагностики. Но это, в общем, другая история. Выше я упоминал об успехе масс-спектрометрии MALDI-TOF для распознавания бактериальных клеток по профилю анализа их целыми, без предварительной обработки. Несколько альтернативных решений для идентификации патогенных бактерий в этой сфере сегодня используют в клинике (рис. 15).
Рисунок 5. Бактериальные клетки, освещенные лучами лазера и покрытые «шубой» из кристаллов фоточувствительной матрицы, распознаются по масс-спектру различных белков в их составе.
рисунок Ольги Пташник
Что касается диагностики опухолей, то протеомика ищет себя в обнаружении биомаркеров для прогностических тестов. Имеется в виду ситуация, когда опухоль уже обнаружена, и требуется определить степень ее злокачественности для того, чтобы правильно выбрать стратегию лечения. Так, ранние попытки анализа MALDI-TOF компонентов крови без их обработки внесли свой вклад в появление разрешенного американскими регуляторами мультиплексного теста OVA1 для прогноза злокачественности опухоли яичника. По справедливости отметим, что сам тест осуществляется уже не с помощью масс-спектрометрии, а иммунными методами.
И конечно, не нужно забывать тот вклад в биологию и медицину, который внесли протеомные методы, использованные в многочисленных фундаментальных исследованиях. Настороженность, связанная с недоверием к новой технологии, давно осталась в прошлом, и масс-спектрометрия белков или белковые микрочипы давно стали завсегдатаями страниц самых цитируемых научных журналов. Конечно, методы сами по себе, как бы они ни были хороши, не могут заменить научную мысль. Но когда биологи, способные ее сгенерировать, сочли протеомные методы достаточно надежными, последние начали приносить очевидную пользу в решении сложных фундаментальных задач
К 6 картинке:
Полные геномные последовательности организмов, в последнее десятилетие появляющиеся как из рога изобилия, говорят учёным о белкáх, закодированных в ДНК, но не о том, в каких именно тканях и клетках и в какие моменты клеточного и организменного развития эти белки реально синтезируются. «Наследник» проекта «Геном человека» — который по аналогии можно назвать «Протеом человека» — призван получить эту информацию, тщательным образом просканировав все ткани и типы клеток человека на предмет полного перечня белков, реально в них присутствующих в тот или иной момент времени. Работа, предполагаемая сложность и трудоёмкость которой многократно превосходит геномные проекты, будет распределена между десятками, если не сотнями, лабораторий и исследовательских центров по всему миру.
Небольшая группа исследователей предлагает вниманию научной общественности амбициозный проект под названием «Протеом человека» (Human Proteome Project), направленный на каталогизацию и характеризацию всех белков, содержащихся в человеческом организме [1]. Однако предполагаемая стоимость инициативы — около 1 миллиарда долларов США — вызывает некоторые сомнения по поводу того, удастся ли учёным получить это финансирование и требуемую поддержку.
Эта идея витала в воздухе ещё в середине 1990-х, когда только обретал форму проект по секвенированию генома человека — естественным «наследником» которого должно был стать протеомное начинание. Однако координированных усилий по «индексации» всех человеческих белков так и не было предпринято — не в последнюю очередь из-за пугающей сложности и методологической неясности этой проблемы. Дело в том, что каждый кодирующий белóк ген способен давать начало десяткам вариантов одного и того же белкá, каждый из которых может ещё дополнительно модифицироваться уже после синтеза, умножая число вариаций до плохо поддающейся оценке величины. Все эти белки имеют индивидуальный уровень экспрессии в различные моменты развития в каждом из более чем двухсот типов человеческих клеток. «Всё это казалось просто за пределами понимания», — говорит Джон Берджерон (John Bergeron) из канадского Университета МакГилла в Монреале, бывший президент организации «Протеом человека» (HUPO, Human Proteome Organization).
Теперь Берджерон и группа учёных-«протеомщиков» предлагают план масштабного проекта по исследованию протеома человека. Предполагается, что в результате проекта будет установлено, какие белки присутствуют в каждой ткани организма, где они располагаются в клетке и с какими ещё белками они взаимодействуют. (Геномная последовательность, в отличие от такой «протеомной карты», лишь указывает место в хромосоме, где находится ген того или иного белка, но не реальную активность этого гена в определённой ткани.) Сторонники проекта утверждают, что подобный «белковый каталог» будет бесценным инструментом в поиске новых фармацевтических мишеней или биомаркеров, служащих для контроля над ходом заболевания.
«Стоимость подобного проекта — это сущие копейки, когда подумаешь о ценности той информации, которую даст картирование „строительных блоков“ Жизни», — говорит Маттиас Улен (Mathias Uhlen) из Королевского технологического института в Стокгольме, который также участвует в организации проекта.
Уже было проведено два симпозиума по обсуждению предстоящего проекта (последний состоялся в январе 2008 г. на о. Барбадос), и организаторы рассчитывают пообщаться с более широким кругом «протеомщиков» по поводу перспектив начинания на конгрессе HUPO в Амстердаме в августе этого года.
Организаторы будущего проекта, разработавшие его черновую версию, считают, что теперь осуществимость планов резко повысилась — учитывая, что число генов, кодирующих белок, сократилось за счёт выявления ошибок в аннотации. Так, одно время считалось, что белки кодируют 50–100 тысяч генов, но, по последним данным, это число было существенно переоценено, и сейчас речь идёт лишь о ≈21 000 генах, что существенно упрощает поставленную задачу. (см. «В полку генов убыло» [2]. — А. Ч.) Кроме того, консорциум планирует сконцентрироваться только на одной форме белкá, производимой каждым гéном, оставляя «за бортом» многочисленные модификации. «Мы избавились от чрезмерной сложности, — заявляет Берджерон. — Задачей было составить проект, выполнимый в обозримые сроки с ограниченными сверху затратами и с чётко обозначенными промежуточными вехами».
В планы исследователей входит использование трёх основных экспериментальные методик, результаты которых будут дополнять друг друга. Первая — масс-спектрометрия, предназначенная для идентификации и определения количества белков в образцах тканей; вторая основывается на получении антител к каждому рассматриваемому белку, чтобы изучить его распределение в тканях и клетках; в задачи третьей входит установление «партнёров» каждого белка — то есть, идентификация всех белок-белковых взаимодействий. Найдётся в проекте место и для биоинформатики — чтобы создать удобные онлайновые базы для хранения и анализа полученных данных. Кроме того, планируется сделать коммерчески доступными библиотеки реагентов и антител, наработанных в процессе работы.
Берджерон планирует, что работа будет разделена между многими лабораториями по всему миру. По его словам, первый этап проекта — включающий, в частности, сбор и анализ уже существующих масс-спектрометрических данных — займёт
около шести месяцев, а последующий за ним «пилотный» проект длительностью от одного до трёх лет будет посвящён детальному анализу всех белков 21-й — самой маленькой — человеческой хромосомы. Весь проект, по его оценкам, займёт около десяти лет.
«Это весьма масштабное начинание для HUPO, равного которому им никогда ещё не приходилось доводить до конца», — говорит Пол Темпст (Paul Tempst), эксперт по протеомике одного из нью-йоркских раковых центров. Организация уже делала несколько менее крупных протеомных проектов — в частности, по исследованию протеомов плазмы крови, печени и мозга, — однако каждый раз оказывалось, что разные лаборатории — даже в пределах одного института — частенько идентифицировали существенно различающиеся наборы белков в одном и том же образце! «Всё это показало, что в плазме крови (и в других образцах тканей) содержится множество разных белков, но вот какие именно — ответ на этот вопрос может быть разным в зависимости от места, где выполняется работа, — если только не будет создано технологической базы, обеспечивающей стандартизацию процессов», — отмечает Темпст.
В ответ на это Берджерон говорит, что технология масс-спектрометрии значительно усовершенствовалась, и теперь большинство проблем с воспроизводимостью результатов при многократных повторах, так долго бросавших тень на всю область, уже решено. Однако другая сложность возникает при анализе образца, содержащего смесь белков в существенно различающихся концентрациях — когда некоторые из них могут быть представлены всего несколькими десятками или сотнями молекул. И как раз в таких ситуациях будут проявляться преимущества «трёхстороннего» подхода — когда недостатки одной технологии могут восполняться достоинствами двух других.
Стивен Карр (Stephen Carr), «протеомщик» из массачусетского Кембриджа, считает, что проект, скорее всего, будет поддержан, однако сомневается относительно деталей «пилотного» проекта. По его мнению, намного более полезным, чем «картирование» протеома одной из хромосом, было бы исследование протеомов митохондриальной или плазматической мембраны, поскольку это наверняка даст массу информации о биологии мембранных процессов и связанных с ними заболеваниях.
Координация проекта «Протеом человека» обещает быть весьма непростой задачей. По сравнению с геномными проектами, где вся работа была выполнена сравнительно небольшим числом слаженно работавших научных центров, тут будет вовлечено намного большее число лабораторий, что гарантирует нездоровую конкуренцию и может снизить эффективность совместной работы. Плюс,
В зависимости от интервала концентраций находящихся в биоматериале белков, число отдельных пятен на двумерных гелях достигало 5 тысяч. С сегодняшней точки зрения очевидно, что это не означает, что на геле визуализированы продукты 5 тысяч генов. Изоформы одного генного продукта, которые отличаются по последовательности за счет гетерозиготности или протеолиза или по более тонкой структуре за счет модификаций остатков, будут, как правило, отражаться в виде отдельных пятен. Например, отщепление одного остатка аргинина от небольшого белка альфа-амилоида так существенно меняло изоэлектрическую точку, что на геле пятно перемещалось примерно на 10 см [10].
Тем не менее двумерная электрофореграмма с визуализированными тысячами белков может считаться первым протеомом — то есть, первым видом анализа, в котором определяется всё множество белков, присутствующих в биологическом образце, или существенная их доля
«Звездное небо» двумерного электрофореза — первый и последний способ увидеть протеом воочию. Более того, при качественной постановке методики человеческого глаза вполне хватает, чтобы обнаружить отличия между похожими пластинами с гелем. Последующие методы протеомики, рассказ о которых впереди, образуют «большие данные», невидимые, как божество. Это обстоятельство во многом сохраняет популярность «двумерника», который используют по сей день, хотя и не так часто, как раньше. Тем не менее в продаже до сих пор имеется оборудование и программное обеспечение для полного цикла выполнения этой методики.
По личным впечатлениям, двумерный электрофорез белков — одна из самых трудоемких и сложных для выполнения биохимических процедур, в которой используются десятки стадий, реагентов и несколько типов лабораторного оборудования. В лаборатории мы в шутку называли тех, кто ставит двумерный электрофорез, «протеомными художниками». И действительно, постановка метода длится два—три дня и требует существенной концентрации на всех ее этапах. Малейшая оплошность приводит к существенному искажению «картины» на геле. Метод не автоматизируется целиком, что и было одной из причин снижения его популярности. Однако он получил второе дыхание уже на рубеже веков, когда в науку ворвался полный геном, а в протеомику вслед за ним —
масс-спектрометрия.
К пятой картинке:
Протеомика и практическая медицина
Ранние работы по прямому анализу компонентов крови для диагностики заболеваний, в особенности, злокачественных опухолей, не привели к впечатляющим результатам. Однако, судя по последним открытиям в биологии рака, под сомнением оказалась сама возможность эффективного использования биохимических маркеров для его первичной, ранней диагностики. Но это, в общем, другая история. Выше я упоминал об успехе масс-спектрометрии MALDI-TOF для распознавания бактериальных клеток по профилю анализа их целыми, без предварительной обработки. Несколько альтернативных решений для идентификации патогенных бактерий в этой сфере сегодня используют в клинике (рис. 15).
Рисунок 5. Бактериальные клетки, освещенные лучами лазера и покрытые «шубой» из кристаллов фоточувствительной матрицы, распознаются по масс-спектру различных белков в их составе.
рисунок Ольги Пташник
Что касается диагностики опухолей, то протеомика ищет себя в обнаружении биомаркеров для прогностических тестов. Имеется в виду ситуация, когда опухоль уже обнаружена, и требуется определить степень ее злокачественности для того, чтобы правильно выбрать стратегию лечения. Так, ранние попытки анализа MALDI-TOF компонентов крови без их обработки внесли свой вклад в появление разрешенного американскими регуляторами мультиплексного теста OVA1 для прогноза злокачественности опухоли яичника. По справедливости отметим, что сам тест осуществляется уже не с помощью масс-спектрометрии, а иммунными методами.
И конечно, не нужно забывать тот вклад в биологию и медицину, который внесли протеомные методы, использованные в многочисленных фундаментальных исследованиях. Настороженность, связанная с недоверием к новой технологии, давно осталась в прошлом, и масс-спектрометрия белков или белковые микрочипы давно стали завсегдатаями страниц самых цитируемых научных журналов. Конечно, методы сами по себе, как бы они ни были хороши, не могут заменить научную мысль. Но когда биологи, способные ее сгенерировать, сочли протеомные методы достаточно надежными, последние начали приносить очевидную пользу в решении сложных фундаментальных задач
К 6 картинке:
Полные геномные последовательности организмов, в последнее десятилетие появляющиеся как из рога изобилия, говорят учёным о белкáх, закодированных в ДНК, но не о том, в каких именно тканях и клетках и в какие моменты клеточного и организменного развития эти белки реально синтезируются. «Наследник» проекта «Геном человека» — который по аналогии можно назвать «Протеом человека» — призван получить эту информацию, тщательным образом просканировав все ткани и типы клеток человека на предмет полного перечня белков, реально в них присутствующих в тот или иной момент времени. Работа, предполагаемая сложность и трудоёмкость которой многократно превосходит геномные проекты, будет распределена между десятками, если не сотнями, лабораторий и исследовательских центров по всему миру.
Небольшая группа исследователей предлагает вниманию научной общественности амбициозный проект под названием «Протеом человека» (Human Proteome Project), направленный на каталогизацию и характеризацию всех белков, содержащихся в человеческом организме [1]. Однако предполагаемая стоимость инициативы — около 1 миллиарда долларов США — вызывает некоторые сомнения по поводу того, удастся ли учёным получить это финансирование и требуемую поддержку.
Эта идея витала в воздухе ещё в середине 1990-х, когда только обретал форму проект по секвенированию генома человека — естественным «наследником» которого должно был стать протеомное начинание. Однако координированных усилий по «индексации» всех человеческих белков так и не было предпринято — не в последнюю очередь из-за пугающей сложности и методологической неясности этой проблемы. Дело в том, что каждый кодирующий белóк ген способен давать начало десяткам вариантов одного и того же белкá, каждый из которых может ещё дополнительно модифицироваться уже после синтеза, умножая число вариаций до плохо поддающейся оценке величины. Все эти белки имеют индивидуальный уровень экспрессии в различные моменты развития в каждом из более чем двухсот типов человеческих клеток. «Всё это казалось просто за пределами понимания», — говорит Джон Берджерон (John Bergeron) из канадского Университета МакГилла в Монреале, бывший президент организации «Протеом человека» (HUPO, Human Proteome Organization).
Теперь Берджерон и группа учёных-«протеомщиков» предлагают план масштабного проекта по исследованию протеома человека. Предполагается, что в результате проекта будет установлено, какие белки присутствуют в каждой ткани организма, где они располагаются в клетке и с какими ещё белками они взаимодействуют. (Геномная последовательность, в отличие от такой «протеомной карты», лишь указывает место в хромосоме, где находится ген того или иного белка, но не реальную активность этого гена в определённой ткани.) Сторонники проекта утверждают, что подобный «белковый каталог» будет бесценным инструментом в поиске новых фармацевтических мишеней или биомаркеров, служащих для контроля над ходом заболевания.
«Стоимость подобного проекта — это сущие копейки, когда подумаешь о ценности той информации, которую даст картирование „строительных блоков“ Жизни», — говорит Маттиас Улен (Mathias Uhlen) из Королевского технологического института в Стокгольме, который также участвует в организации проекта.
Уже было проведено два симпозиума по обсуждению предстоящего проекта (последний состоялся в январе 2008 г. на о. Барбадос), и организаторы рассчитывают пообщаться с более широким кругом «протеомщиков» по поводу перспектив начинания на конгрессе HUPO в Амстердаме в августе этого года.
Организаторы будущего проекта, разработавшие его черновую версию, считают, что теперь осуществимость планов резко повысилась — учитывая, что число генов, кодирующих белок, сократилось за счёт выявления ошибок в аннотации. Так, одно время считалось, что белки кодируют 50–100 тысяч генов, но, по последним данным, это число было существенно переоценено, и сейчас речь идёт лишь о ≈21 000 генах, что существенно упрощает поставленную задачу. (см. «В полку генов убыло» [2]. — А. Ч.) Кроме того, консорциум планирует сконцентрироваться только на одной форме белкá, производимой каждым гéном, оставляя «за бортом» многочисленные модификации. «Мы избавились от чрезмерной сложности, — заявляет Берджерон. — Задачей было составить проект, выполнимый в обозримые сроки с ограниченными сверху затратами и с чётко обозначенными промежуточными вехами».
В планы исследователей входит использование трёх основных экспериментальные методик, результаты которых будут дополнять друг друга. Первая — масс-спектрометрия, предназначенная для идентификации и определения количества белков в образцах тканей; вторая основывается на получении антител к каждому рассматриваемому белку, чтобы изучить его распределение в тканях и клетках; в задачи третьей входит установление «партнёров» каждого белка — то есть, идентификация всех белок-белковых взаимодействий. Найдётся в проекте место и для биоинформатики — чтобы создать удобные онлайновые базы для хранения и анализа полученных данных. Кроме того, планируется сделать коммерчески доступными библиотеки реагентов и антител, наработанных в процессе работы.
Берджерон планирует, что работа будет разделена между многими лабораториями по всему миру. По его словам, первый этап проекта — включающий, в частности, сбор и анализ уже существующих масс-спектрометрических данных — займёт
около шести месяцев, а последующий за ним «пилотный» проект длительностью от одного до трёх лет будет посвящён детальному анализу всех белков 21-й — самой маленькой — человеческой хромосомы. Весь проект, по его оценкам, займёт около десяти лет.
«Это весьма масштабное начинание для HUPO, равного которому им никогда ещё не приходилось доводить до конца», — говорит Пол Темпст (Paul Tempst), эксперт по протеомике одного из нью-йоркских раковых центров. Организация уже делала несколько менее крупных протеомных проектов — в частности, по исследованию протеомов плазмы крови, печени и мозга, — однако каждый раз оказывалось, что разные лаборатории — даже в пределах одного института — частенько идентифицировали существенно различающиеся наборы белков в одном и том же образце! «Всё это показало, что в плазме крови (и в других образцах тканей) содержится множество разных белков, но вот какие именно — ответ на этот вопрос может быть разным в зависимости от места, где выполняется работа, — если только не будет создано технологической базы, обеспечивающей стандартизацию процессов», — отмечает Темпст.
В ответ на это Берджерон говорит, что технология масс-спектрометрии значительно усовершенствовалась, и теперь большинство проблем с воспроизводимостью результатов при многократных повторах, так долго бросавших тень на всю область, уже решено. Однако другая сложность возникает при анализе образца, содержащего смесь белков в существенно различающихся концентрациях — когда некоторые из них могут быть представлены всего несколькими десятками или сотнями молекул. И как раз в таких ситуациях будут проявляться преимущества «трёхстороннего» подхода — когда недостатки одной технологии могут восполняться достоинствами двух других.
Стивен Карр (Stephen Carr), «протеомщик» из массачусетского Кембриджа, считает, что проект, скорее всего, будет поддержан, однако сомневается относительно деталей «пилотного» проекта. По его мнению, намного более полезным, чем «картирование» протеома одной из хромосом, было бы исследование протеомов митохондриальной или плазматической мембраны, поскольку это наверняка даст массу информации о биологии мембранных процессов и связанных с ними заболеваниях.
Координация проекта «Протеом человека» обещает быть весьма непростой задачей. По сравнению с геномными проектами, где вся работа была выполнена сравнительно небольшим числом слаженно работавших научных центров, тут будет вовлечено намного большее число лабораторий, что гарантирует нездоровую конкуренцию и может снизить эффективность совместной работы. Плюс,