ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 14.10.2024
Просмотров: 40
Скачиваний: 0
16 |
Интерфазное ядро |
Кернс ше обнаружил |
(Cairns, 1966), что при короткой им |
пульсной Н3-тимидиновой |
метке ДНК из клеток HeLa состоит |
из многих отдельно реплицирующихся отрезков, соединенных последовательно.
Эти наблюдения подтвердили и развили в подробном исследо вании Хюберман и Риггс (Huberman, Riggs, 1968). Краткие итоги их наблюдений следующие. Длинные фибриллы хромосом ной ДНК построены из многих последовательно друг с другом соединенных участков репликации. ДНК реплицируется в вилко образных точках роста. Обычно ДНК синтезируется в противо положных направлениях в смежных зонах репликации. Каждый репликон ограничен точкой начала репликации и термальной точкой, поэтому в каждом репликоне удвоение ДНК будет идти от точки начала репликации к терминальной точке. Средняя величина репликона — 30 мк, хотя встречаются репликоны очень короткие (несколько микрон) и очень длинные — до 160 мк. Соседние репликоны могут реплицироваться в разное время. Скорость репликации составляет около 2,5 мк в 1 мин.
По данным Кернса о репликации ДНК у Е. coli нельзя было выяснить, идет ли рост дочерней молекулы ДНК в одном направ лении или в двух противоположных, как это показано для ДНК животных (Huberman, Riggs, 1968). Но в недавней работе (Wake, 1972) была обнаружена двунаправленная репликация ДНК у
Bacillus subtilis.
В серии работ Тейлора (Taylor, Miner, 1968; Taylor et al., 1968; Schandl, Taylor, 1969) показано, что внутри репликонов синтез ДНК идет путем начального синтеза коротких отрезков ДНК (около 1000 нуклеотидов), которые быстро сшиваются в более длинные цепи длиной до 10—40 мк; эти последние в свою очередь сшиваются, давая гигантские цепи хромосомных ДНК. Таким образом, вероятно, механизм репликации в принципе оди наков у ядерных и безъядерных организмов, но эукариоты отли чаются тандемным линейным расположением репликонов в ги гантской незамкнутой молекуле ДНК.
Существуют единичные данные о циклических ДНК у высших организмов. Так, Хотта и Бассель (Hotta, Bassel, 1965), исследуя ДНК, получепную из спермы быка и проростков пшеницы, с помощью электронного микроскопа наблюдали циклические ДНК, сильно гетерогенные по своей величине. Значение этих наблю дений кажется сомнительным, так как циклические формы ДНК в препаратах могут быть или продуктом загрязнения ядерной ДНК митохондриальной ДНК, или результатом ренатурации мо лекул ДНК в местах разрывов с одинаковыми повторяющимися последовательностями (Thomas et al., 1970; Stevens, Moustacchi, 1971),
I. Структура хромосом |
17 |
Белки хроматина |
|
В состав хроматина, кроме ДНК, входят различные белки, боль шая часть которых приходится на гистоны (Буш, 1967; Frambrough, 1969).
Гистоны могут быть отделены от ДНК с помощью солевых растворов высокой ионной силы или кислот.
По свойствам гистоны относятся к белкам, богатым такими основными аминокислотами, как лизин и аргинин, которые опре деляют их положительный заряд. Гистоны присоединены к ДНК главным образом ионными связями, при этом катионные группы гистонов нейтрализуют фосфатные группы ДНК. Содержание гистонов в хроматине равно количеству ДНК, хотя зависит от того, какие клетки изучаются. Максимальное отношение мас сы гистон: ДНК в нуклеогистоне, в котором кислотные группы ДНК будут полностью связаны с основными белками, должно составлять приблизительно 1,35 : 1. Однако в большинстве слу чаев это отношение меньше.
По данным Боннера (Bonner, 1965), в хроматине развиваю щихся семядолей гороха содержится 0,9 того количества гистона, которое необходимо для эквивалентного соотношения гистона и ДНК; для хроматина зародышей гороха эта величина составляет 0,8. Эти различия могут определяться степенью матричной ак тивности ДНК, т. е. степенью репрессированное™ генома.
Гистоны представлены несколькими группами или фракция ми, которые отличаются друг от друга по аминокислотному составу, хотя все они схожи отсутствием цистеина, цистина и триптофана, бедностью тирозином и фенилаланином. Хромато графическое разделение гистонов на колонках с ионнообменниками позволяет получить четыре основные фракции гистонов. Первая из фракций, обычно называемая F,, богата лизином и бедна аргинином, третья и четвертая фракции содержат большие количества аргинина и мало лизина, вторая фракция содержит эти аминокислоты в приблизительно равных количествах. В ра ботах из лаборатории Боннера (Frambough, Bonner, 1966) пока зано, что каждая фракция, за исключением фракции Па, являет ся гомогенной фракцией. Гетерогенность гистоновых фракций, полученных в прежних работах, по мнению авторов, объясняется загрязнением или наличием продуктов протеолиза гистонов.
Было показано (Ohlenbush et al., 1967; Георгиев и др., 1967; Smart, Bonner, 1971), что, используя растворы разной ионной силы, можно последовательно извлекать из ДНК различные ги стоны. Так, 0,6 М раствор NaCl извлекает только гистоны первой фракции, гистоны, богатые лизином; растворы 0,8 —1,5 М NaCl экстрагируют гистоны второй фракции; гистоны III и IV фракций
Гое.публи |
мая |
научно * техм |
. «я* |
18 Интерфазное ядро
экстрагируются более высокими концентрациями солей. Это позволило подойти вплотную к изучению вопроса о функцио нальной роли этих белков.
В многочисленных работах лаборатории Боннера (Bonner, 1965; Bonner et al., 1968) показано, что матричная активность ДНК в составе хроматина зависит от количества связанного с ней
гистона. Простая экстракция |
гистона из хроматина приводила |
к повышению синтеза РНК |
на хроматине. Об этом же говорят |
данные о матричной активности хроматина из разных объектов: степень этой активности была прямо пропорциональна количеству ДНК, не связанной с гистоном. Отсюда делался прямой вывод о том, что гистоны являются репрессорами матричной активности ДНК в составе хроматина.
Как оказалось (Bonner et al., 1968; MacGillivray, 1968), ги стоны из клеток разных тканей, а также гистоны клеток разных организмов очень схожи. Поэтому было неясно, как такая чис ленно ограниченная группа белков может осуществлять регуля цию репрессии и дерепрессии разных генов, обладающих самой разнообразной нуклеотидной последовательностью.
Боннер и его сотрудники (Bonner et al., 1968; Shin, Bonner, 1969; Holmes et al., 1972) обнаружили, что при экстракции и раз делении гистонов и ДНК в градиенте плотности CsCl в зоне ги стонов содержится малое количество (0,01—0,05% от массы ДНК) РНК, отличной от других известных типов РНК. Эта хро мосомная РНК, видимо, связана с белком, так как устойчива к действию РНК-азы. Хромосомная РНК отделяется от ДНК хро матина нагреванием растворов, что может свидетельствовать о ее комплементарной связи с ДНК. Хромосомная РНК состоит из ко ротких цепей, содержащих около 40—60 нуклеотидов. По своему составу она гетерогенна (связывает около 5% денатурированной ДНК). Авторы считают, что эта хромосомная РНК ковалентно связана с белком, который с помощью водородных связей комплексируется с гистонами. Специфичность репрессирующего дейст вия гистонов, следовательно, определяется специфичностью от дельных молекул хромосомных РНК, которые могут комплемен тарно связываться с определенными местами на ДНК; к такому комплексу затем присоединяется гистон. В пользу этих представ лений говорят следующие эксперименты. Нуклеогистон подвер гается воздействию 2 М NaCl, чтобы вызвать полную диссоциацию ДНК и гистонов. Если затем проводить реконструкцию нуклеогистона путем понижения концентрации солей в среде диализом против воды, то гистоны связываются вновь с ДНК, но беспоря дочно. Это доказывается тем, что РНК, синтезированная на таком нуклеогистоне in vitro, не вступает в конкурентные взаимоотно шения с РНК, синтезированной на нативном хроматине при гиб ридизации ее с денатурированной ДНК, т. е. нуклеотидные по
t. Структура Х0ОМОС6Ш |
19 |
следовательности этих РНК разные. Следовательно, посадка ги стонов на ДНК в случае такой реконструкции была неспецифи ческой. Однако удалось получить специфическую реконструкцию в присутствии мочевины, которая как объясняют авторы, облег чает начальную гибридизацию РНК с ДНК. При удалении хро мосомной РНК такой специфической реконструкции хроматина не происходит.
Дж. Полу и Гилмуру (Paul, Gilmour, 1968, Paul et al., 1970)
удалось получить специфическую реконструкцию хроматина толь ко в присутствии на ДНК белковых остатков, негистонового ти па, после удаления только одних гистонов. Специфическая рекон струкция нуклеогистона не происходит, так же как и у Боннера, если брать полностью депротепнизированпую ДНК и гистоны. Пол и Гилмур считают, что гистоны действительно могут закры вать ДНК в хроматине и предотвращать ее работу в качестве ма трицы для синтеза РНК, но этот эффект неспецифичен; другие, не гистоновые, белки ответственны за обнажение специфических по следовательностей на ДНК (Paul et al., 1970).
Совсем иные представления о функциональной роли гистонов высказываются >в работах из лаборатории Мирского (Allfrey et al., 1966; Allfrey, 1970). Необходимой предпосылкой для синтеза но вых РНК на ранее репрессированных генных локусах является, по их мнению, изменение структуры хроматина, вызванное аце тилированием гистонов или происходящее одновременно с этим процессом. Другой признак активного хроматина — фосфорили рование серина в ядерных белках, в том числе в гистонах. Фосфо рилирование связанных с хромосомами белков влияет на взаимо действие ДНК с гистонами и приводит к сдвигу от компактного состояния (неактивного) к диффузному (активному); дефосфори лирование может снова привести к плотному скручиванию ком плекса ДНК — гистон. Олфри и др. (Allfrey et al., 1966) разделя ют точку зрения о том, что часть ядерной РНК может играть роль регуляторов или «распознавателей».
Гистоны, связываясь с ДНК, вызывают агрегацию хроматина в условиях растворов с ионной силой, близкой к физиологиче ским растворам (0,05—0,2 М NaCl). Это свойство гистонов может отражать их другую функцию, структурную. Удаление части гис тонов с помощью 0,6 М NaCl приводит к растворению осадка хро матина (Lucy, Butter, 1955). Обработка хромосом трипсином при водит к их набуханию и диспергированию (Буш, 1967; Cole, 1967; Cole, Lungley, 1966), так же как и помещение их в солевые растворы. Эти наблюдения указывают в первую очередь на роль гистонов как факторов, поддерживающих или определяющих структуру хромосом и хроматина. Очевидно, что гистоны, вза имодействуя с ДНК, функционируют не только как репрессоры, но и как факторы структуризации хроматина (Johns, 1972). По пред
20 Йнтерфазное ядро
ставлениям Зюби (Zubay, 1964), гистоны могут образовывать мос тики между молекулами ДНК, что может приводить к сверхскру чиванию ДНК в составе хроматина и хромосом.
Вероятнее всего, что эти две функции гистонов (репрессия матричной активности и структуризация ДНП) тесно связаны между собой. В пользу этого говорят опыты Георгиева и сотр. (1967), в которых показано, что удаление фракции гистонов, бо гатых лизином (Fj), приводит, с одной стороны, к резкому увели чению матричной активности, а с другой стороны, к изменению структуры хроматиновых фибрилл, к их утоныпению до 40 А. В неактивном (или слабоактивном) состоянии фибриллы хромати на имеют толщину 100—200 А. Вероятнее всего, что изменение толщины фибрилл связано не просто с потерей белка (при экстрак ции гистонов 0,6 М NaCl удаляется около 20—25% суммарного белка ДИП), а с перестройкой самой структуры молекул дезоксирибонуклеопротеида.
Георгиев и сотр. (1970) показали, что обработка препаратов ДНП 4 М растворами мочевины приводит к растворению ДНП без потери его белковых компонентов, при этом нити ДНП утонь шаются до 40 А. Авторы объясняют это тем, что мочевина нару шает слабые взаимодействия типа водородных связей и, возмож но, гидрофобные взаимодействия, ответственные за образование сшивок между разными участками молекулы ДНП или между
молекулами ДНП. |
(Pardon et al., 1967) |
Данные рентгеноструктуриого анал1 |
также говорят о сверхспирализации ДНК в составе ДНП, в ре зультате чего возникает вторичная спираль с шагом 120 А и диа
метром 100 А.
Гистоны играют большую роль в структуризации хроматина не только на уровне макромолекул. Известно, что ядра многих клеток обладают двумя формами хроматина: компактным — плот ным и диффузным — рыхлым. В ядрах лимфоцитов образование компактных масс хроматина связано с высоким содержанием в них лизинового гистона. Ауторадиографически было найдено, что зоны плотного хроматина неактивны в отношении синтеза РНК, в то время как диффузные зоны хроматина включают меченые предшественники РНК (Unuma et al., 1968). Эти две формы хро матина удалось выделить препаративно (Frenster et al., 1963). Структуризирующая роль гистонов, богатых лизином, показана на выделенных ядрах и хромосомах (Mirsky et al., 1968). Если экстрагировать гистоны, богатые лизином, из выделенных хромо сом, то последние разрыхляются и под электронным микроско пом имеют вид сетчато-фибриллярных структур. Добавление к таким экстрагированным хромосомам гистонов, богатых лизином, приводит к восстановлению исходной плотности структуры хро мосом. Интересно, что добавление к хромосомам, лишенным ли-