Файл: Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра.pdf

зинового гистона, избытка гистонов, богатых аргинином, не при­ водит к восстановлению структуры хромосом. Авторы приходят к выводу, что гистоны, богатые лизином, образуют поперечные сшивки между фибриллами ДНП.

Выше мы уже останавливались на роли части негистоновых белков в процессах взаимодействия гистонов с ДНК. О структур­ ной роли других негистоновых белков, входящих в состав хрома­ тина, известно очень немного (Буш, 1967).

Структура молекул дезоксирибонуклеопротеидов по данным электронной микроскопии

Как видно из предыдущего изложения, основной морфологи­ ческой структурой, встречающейся в составе хроматина и хромо­ сом, являются фибриллы дезоксирибонуклеопротеидов. В литера­ туре существует масса описаний структуры ядра и хромосом с помощью электронного микроскопа, однако первым обобщающим исследованием была работа X. Риса (Bis, 1957), где он выдвинул представление об элементарных структурных единицах в составе хромосом.

К сожалению, до настоящего времени метод электронной мик­ роскопии внес мало нового в решение вопроса о молекулярной ор­ ганизации фибрилл хроматина. Информация, полученная этим методом, касается в основном размеров, толщины отдельных фиб­ рилл, их переходов и изменений. Сведений о пространственном расположении белков и ДНК в составе ДНИ, полученных с по­ мощью электронной микроскопии, в настоящее время не имеется. Первые попытки электронномикроскопического исследования хромосом были сделаны на выделенных препаратах и не принесли успеха, так как в этих случаях применялась жесткая обработка ядерного материала.

Так, например, Эльверс (Elvers, 1942) обрабатывал пахитенные хромосомы развивающихся пыльцевых клеток смесью спир­ та с уксусной кислотой, пепсином и трипсином для разрыхления этих структур. Было отмечено, что хромосомы состоят из продоль­ но расположенных нитей. Сходные результаты получил Бухольц (Bucholz, 1947), который, кроме нитей, обнаружил в хромосомах гранулы диаметром от 750 до 4300 А.

Не привели к успеху и попытки изучения выделенных хро­ мосом из интерфазных ядер (Yasuzumi, Yamamoto, 1953). Нити хроматина у разных объектов в выделенном состоянии значитель­ но различались по толщине. Так, хроматиновые нити из ядер эритроцитов цыпленка имели толщину до 500 A (Hovanitz, 1947), нити ядер лейкоцитов человека и эритроцитов карпа —50—100 А (Yasuzumi, 1955; Yasuzumi, Higashizawa, 1955).

22 Интерфазное ядро

Введение в практику электронной микроскопии фиксации объ­ ектов с помощью четырехокиси осмия (0s04) и методов изготов­ ления ультратонких срезов резко увеличило число исследований, посвященных структуре клеточного ядра и хромосом.

При использовании фиксирующих растворов, содержащих 0s04, было замечено, что интерфазные ядра на ультратонких сре­ зах имеют более или менее гомогенную структуру, состоящую из гранул или коротких нитей (Porter, 1955; Policard, Boud, 1958).

Заметить в ядрах какую-либо структуризацию, кроме небольших участков конденсированного хроматина, хромоцентров и ядрышек, не удается. Примерно такая же ситуация отмечена при исследо­ вании ультратонких срезов хромосом. В хромосомах не выявляет­ ся каких-либо структур, кроме мелких зерен и тонких волокон, расположенных равномерно без определенной ориентации (Por­ ter, 1955).

Большие разногласия имеются как в старой, так и в новейшей литературе о толщине этих фибриллярных образований в ядре и в хромосомах.

На ультратонких срезах ядер эритроцитов рыб Ясуцуми и Хи-

гашицава (Yasuzumi, Higashizawa, 1955) обнаружили фибриллы толщиной 100—200 А. В ядрах лимфоцитов мышей выявлены фибриллы толщиной 110—130 A (Amano et al., 1956), в ядрах пе­ чени крыс обнаружены фибриллы толщиной 100 A (Davison, Mer­ cer, 1956), и 100—150 А (Георгиев, Ченцов, 1960). Нити толщиной 100—200 А были описаны Рисом (Ris, 1957) в ядрах растений.

Примерно такая же картина наблюдалась при изучении сре­ зов хромосом.

Несмотря на такие противоречивые и неоднозначные наблю­ дения, все же вырисовывается общая картина, а именно: в со­ ставе хроматина как интерфазных ядер, так и хромосом во время митоза и мейоза постоянно выявляются фибриллярные образо­ вания, имеющие толщину в пределах 100 —200 А. Подобного ро­ да наблюдения послужили основанием для появления обобщений, сделанных Г. Рисом (Ris, 1957), одним из пионеров электронно­ микроскопического изучения хромосом и ядер, который ввел по­ нятие об элементарной структурной единице хромосомы. Такими элементарными единицами являются нити макромолекул ДНП (нуклеогистонов).

Более поздние работы Риса (Ris, 1966, 1967, 1968) связаны с новыми методическими подходами. В этих исследованиях особое внимание было обращено на общую характерную черту препара­ тов ДНП, а именно на то, что эти препараты состоят из нитей толщиной 200—250 А, обладающих многочисленными боковыми ответвлениями, придающими им сетчатый вид. Природа этих бо­ ковых ответвлений становится ясной, если ДНП быстро обрабо­ тать растворами цитрата натрия или ЭДТА. В этом случае вид­

но, что каждая нить толщиной 250 А состоит из двух параллель­ ных нитей толщиной по 100 А каждая. Боковые ответвления, по-видимому, образуются тогда, когда нить толщиной 100 А обра­ зует вытянутую петлю, стороны которой соприкасаются одна с другой. В этом случае по крайней мере боковые ответвления со­ стоят не из двух независимых нитей толщиной по 100 А, а из од­ ной, которая в этом месте сложена вдвое. При детальном рассмот­ рении видно, что эти нити не обладают строго одинаковой толщи­ ной, а имеют узловатый характер за счет многочисленных корот­ ких ответвлений. Если такие нити обработать непосредственно на препарате проназой, то остается видна только нить толщиной 25 А, которая оказывается чувствительной к ДНК-азе. Исходя из этих наблюдений, Рис приходит к заключению, что нить ДНП толщи­ ной 100 А состоит из одиночной молекулы ДНК в сочетании с белком. Гистоны изгибают ДНК в короткие петли толщиной до 60 А; такая петлистая нить ДНК вместе с белком образует уз­ ловатую фибриллу толщиной в 60—100 А, которая под влиянием дивалентных катионов образует разветвленную систему спарен­ ных нитей с конечной толщиной 200—250 А. Насколько правиль­ но эти представления отражают структуру хроматина в интерфаз­ ных ядрах живых клеток, пока неясно.

Серия работ Риса способствовала расширению исследований ультраструктуры клеточных ядер и хромосом. Появились группы исследователей, интенсивно занимающихся электронной микро­ скопией хроматина (Wolfe, 1965, 1968; Du Praw, 1965, 1966, 1968, 1970; Solari, 1965, 1968; Gall. 1963b; 1966).

Однако в исследованиях разных авторов продолжали встре­ чаться противоречивые данные о диаметре элементарных фибрилл хроматина и их тонкой организации.

Большое различие во мнениях о размерностях фибрилл на­ блюдается в тех исследованиях, где авторы изучали строение хро­ матина, выделенного с помощью хелатных агентов, или после об­ работки солевыми растворами, или же после окраски выделенных препаратов в кислой среде. Надо оговориться, что в большинстве этих работ ЭДТА или солевые растворы применялись, главным образом, не для того, чтобы вызвать структурные изменения хро­ матина, а просто потому, что эти реагенты входили в стандартные среды для выделения ядер или хроматина.

Так, Хайд (Hyde, 1964) разрывал ядра, обработанные 3 М ацетатом аммония для удаления гистонов, на поверхности воды и получал фибриллы толщиной от 50 до 100 А. Соляри (Solari, 1965) после обработки спермы морского ежа раствором ЭДТА получал фибриллы толщиной до 40 А, которые вдвое утоньшались после экстракции гистонов 2 М NaCl. Изучая ультраструктуру элемен­ тарных фибрилл хромосом клеток HeLa, Какефуда и Киносита

(Kakefuda, ICinosita, 1966) обрабатывали ядра 0,2%-ным цитра­

24 Интерфазное ядро

том натрия и 2 М раствором NaCl и получали нити до 40 А тол­ щиной.

Та же картина наблюдалась при изучении выделенных мито­ тических хромосом. Барникот (Barnicot, 1967) изучал выделен­ ные хромосомы тритона при окраске 2%-ным уранилацетатом в кислой среде (pH 4,7) и обнаружил фибриллы толщиной до 150 А, в структуре которых после удаления ионов Са из среды отмеча­ лись более мелкие изогнутые субъединицы толщиной по 50 А. Сю (Hsu, 1968) в сперматидах асцидий наблюдал фибриллы тол­ щиной 120—180 А, состоящие из двух субъединиц по 50—70 А.

Другая группа исследований была начата после введения Голлом (Gallb, 1963) метода разыва клеток и распластывания хро­ матина на водном мениске в чашке Лапгмюра. Вначале Голл (Gallb, 1963), используя ядерные эритроциты тритонов, отметил в них фибриллы толщиной 400—600 А; эта величина оказалась ошибочной. Позднее Голл (Gall, 1966), соглашаясь с критикой Риса (Ris, Chandler, 1963), описывает хроматиновые фибриллы толщиной 250—300 А в эритроцитах тритона, в хромосомах сперматоцитов кузнечика и в хромосомах клеток культуры ткани. Серию работ провел Дю Про (Du Praw, 1968). Хромосомы, выде­ ленные при разрыве клеток в гипотонической среде из многочис­ ленных объектов [эмбриональные клетки пчел (Du Praw, 1965), лейкоциты человека (Du Praw, 1966), политенные хромосомы (Du Praw, Rae, 1966)], состоят из фибрилл с постоянной толщи­ ной около 230—250 А. Сходные результаты получены в работах Вольфе (Wolfe, 1965, 1968). Он также в ядерных эритроцитах, в хроматине растений, в хромосомах из культур почек телят, в мейотических хромосомах насекомых обнаружил фибриллы диамет­ ром около 250 А. Сходные данные получены Соляри (Solari, 1965, 1968) на сперме морского ежа, Абуэло и Мур (Abuelo, Moore, 1969) на хромосомах человека.

Суммируя наблюдения о размерах элементарных структурных единиц хроматина интерфазных ядер и митотических хромосом, можно отметить следующее. При выделении и исследовании хроматиновых фибрилл в условиях набухания нуклеопротеидов и полного сохранения связей гистонов с ДНК в электронном мик­ роскопе постоянно выявляются фибриллы со стандартной толщи­ ной порядка 200—250 А. В условиях связывания двувалентных катионов или удаления всех или части белков в хроматине на­ блюдаются фибриллы значительно меньшего диаметра — вплоть до 25 А (толщина нативной молекулы ДНК). При обработке ткани Os04 для исследования на ультратонких срезах в хроматине обна­ руживаются большей частью фибриллы толщиной порядка 100 А.

Другой вопрос, интересовавший исследователей: какова моле­ кулярная организация элементарных хромосомных фибрилл. Как уже показано выше, одно из объяснений структуры нуклеопроте-