Файл: Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра.pdf

идных фибрилл предложил Рис (Ris, Chandler, 1963, 1967), по мне­ нию которого каждая фибрилла толщиной 200 А состоит из не­ скольких или по крайней мере из двух параллельно лежащих

субъединиц.

Противоположной точки зрения придерживается Дю Про

(Du Praw, 1968). Исходя из данных Тейлора (Taylor, 1963) о том,

что хромосомы при их редупликации ведут себя так, как если бы они состояли из одной двойной спирали ДНК, Дю Про считает, что в состав хромосом должна входить одна макромолекула ДНП, т. е. одна фибрилла хроматина диаметром 230 А. В этом случае в состав такой фибриллы должна входить одна гигантская цепь ДНК, которая вторично спирально закручена в отношении

10: 1.

Голл (Goll, 1966) также приходит к заключению, что нет до­ казательств многонитчатой природы отдельных нуклеогистоновых фибрилл; их структуру скорее можно объяснить скручиванием или спирализацией более тонких одиночных нитей толщиной око­ ло 50 А.

Дю Про (Du Praw, 1968; Du Praw, Bahr, 1968), измеряя массу сухого вещества в фибриллах ДНП толщиной 230 А, исходил из того, что поглощение электронов объектом линейно связано с его общей сухой массой, и пришел к заключению, что каждый микрон элементарной фибриллы должен в среднем содержать до 1,18— —6, 1-10-16 г ДНК, что соответствует 20—200 мк двойной спирали ДНК. Следовательно, молекула ДНК в такой фибрилле должна быть уложена в среднем отношении 56:1. Дю Про считает, что такая плотная упаковка не может быть обеспечена только лишь одной сверхспирализацией ДНК; по-видимому, вторичная спирализация ДНК должна сочетаться с дополнительными способами укладки этих молекул.

Дю Про (Du Praw, Bahr, 1968), исследуя выделенный хрома­ тин, обратил внимание на то, что в препарате, кроме обычных фибрилл толщиной порядка 200 А (В-тип), встречаются тонкие фибриллы около 35—60 А толщиной (А-тип). Эти тонкие фибрил­ лы не так сильно скручены и более симметричны. В составе хро­ мосом и гетерохроматиновых сгустков ядра встречаются только толстые фибриллы В-типа. По мнению автора, фибриллы А-ти- па — исходные дезоксирибонуклеопротеиды, которые могут скру­ чиваться и давать фибриллы В-типа. Сходные наблюдения сдела­ ли Боннер и Гриффит (Bonner, Griffith, 1969), которые считают, что тонкие фибриллы могут представлять собой фибриллы ДНП из активного хроматина, на которых происходит считывание РНК.

Предположение о том, что нуклеогистоновая фибрилла с од­ ной молекулой ДНК может путем закручивания образовывать более толстые нитчатые образования, неоднократно высказыва­ лось авторами. Так, Амано и др. (Amano et al., 1956) считали, что

вся хромосома состоит йз целого ряда спйрально скрученных протохромонем. Тонкая вить протохромонемы толщиной 20—30 А, бу­ дучи свернута в спираль, образует субхромонему толщиной 260— 300 А. Каждая субхромонема, спирализуясь, образует хромонему толщиной 1000—1200 А, а последняя таким же порядком образует хромосому толщиной 5000 А. Сходные представления развивали Бопп-Хассенкамп (Bopp-Hassenkamp, 1959), Коле (Cole, 1962). При рассмотрении этих данных электронной микроскопии об органи­ зации элементарных хромосомных фибрилл бросаются в глаза чрезвычайная пестрота и неоднозначность в описании и интерпре­ тации морфологических свойств этих фибрилл. Действительно, толщина фибрилл хромосом, по данным разных авторов, колеблет­ ся от 15 до 600 А. Представления о молекулярной организации фибрилл ДНП также неоднозначны. Встречаются высказывания о многонитчатости этих структур, с одной стороны, и об однонитчатости их, с другой. Предлагаются различные способы укладки ДНК в фибриллах ДНП: сверхскручивание, сверхспирализация, расположение бок о бок и т. д. Поэтому в литературе в настоящее время нет еще достоверных, устоявшихся и прошедших проверку экспериментом и временем сведений о молекулярной организации фибрилл ДНП.

И все же при такой пестроте наблюдений и представлений вы­ рисовывается общая картина о свойствах элементарных хромо­ сомных нитей. В зависимости от методов получения или обработки материала в размерах изучаемых хромосомных фибрилл наблю­ дается некоторая закономерность. Большей частью описываются фибриллы, которые можно грубо отнести к трем классам по их толщине: фибриллы толщиной около 200 А, около 100 А и около 40—60 А. Вероятнее всего, эти величины могут отражать свойства фибрилл ДНП как очень динамичных структур, меняющих свою организацию в зависимости от физико-химических условий. Воз­ можно, что такая структурная подвижность молекул ДНП необхо­ дима для того, чтобы обеспечить динамику их функционального перехода от активного состояния к пассивному и наоборот.

Структурная пластичность фибрилл ДНП

Начальным и необходимым этапом в изучении структуры хромо­ сом как в интерфазном ядре, так и во время митоза является изу­ чение их составных компонентов — фибрилл ДНП.

Как показано выше, единого мнения о размере и молекуляр­ ной композиции этих элементарных единиц хромосом, к сожале­ нию, нет. Непонятно то обстоятельство, что на ультратонких сре­ зах ядер большей частью выявляются фибриллы диаметром около 100 А, так же как и в препаратах ДНП, выделенных из ядер по

общепринятому методу Зюби и Доти (Zubay, Doty, 1959), в то вре­ мя как при выделении фибрилл ДНП на поверхности водных ра­ створов (Gallb, 1963) выявляются исключительно фибриллы диа­ метром около 200—250 A (Ris, 1963). Поэтому необходимо выяс­ нить, является ли такая морфологическая пестрота одних и тех же препаратов отражением реально существующей картины орга­ низации клеточного ядра или же это результат обработки.

Кроме того, при изучении хроматина и хромосом необходимо подобрать такие условия фиксации и обработки, которые давали бы однозначные результаты при полном сохранении морфологии всех клеточных структур, результаты, которые на данном этапе развития знаний и методических подходов можно было бы считать наиболее близкими к прижизненным.

В наших исследованиях мы также пытались решить вопрос о структурной организации элементарных фибрилл ДНП и пришли к выводу об их чрезвычайной лабильности и пластичности. Оказа­ лось, что очень многие факторы, такие как способ выделения пре­ паратов ДНП и ядер, ионный состав среды, фиксация, окраска, могут вызывать резкие структурные изменения элементарных хромосомных фибрилл.

Первое, на что было обращено вимание — это условия выделе­ ния препаратов ДНП. Действительно, распластывание на мениске водных растворов с низкой ионной силой ядерных эритроцитов амфибий (по Голлу) (Gallb, 1963) или выделение при низких ион­ ных силах ядер клеток печени крыс давало препараты хроматина со стандартной средней толщиной фибрилл 200—250 А, если такие препараты фиксировались в монослое или прямо на формваровых подложках 70%-ным этанолом, 2,5—5%-ным раствором глютарового альдегида или 2%-ным раствором формальдегида. Окраска водными растворами уранилацетата при кислых значениях pH не меняла структуры и диаметра таких фиксированных хромосомных фибрилл. Однако 1%-ные водные растворы уранилацетата оказы­ вали определенное влияние на морфологию фибрилл, если не про­ водилась их предварительная фиксация. В этом случае диаметр фибрилл колебался от 200 А вплоть до 40—60 А. Вероятнее всего, это связано не только с действием высоких значений pH, но и с высокой ионной силой растворов уранилацетата.

Низкая ионная сила растворов при получении препаратов ДНП, очевидно, резко отлична от той, которая существует в ядрах живых клеток. Поэтому закономерно возникает вопрос, насколько соответствует структура фибрилл, выделенных при низкой ионной силе, структуре фибрилл в изотонических растворах. Хотя мы не можем в данное время нарисовать достоверную картину ионного окружения хроматина в живом ядре, все же изотонические раство­ ры более «физиологичны». Оказалось, что общая картина строения фибрилл ДНП в ядрах печени, выделенных в изотонических рас­

28 Интерфазное ядро

творах (Сенченков, Манамшьяи, 1970), или фибрилл ДНП в ядрах эритроцитов тритона, разрушенных на поверхности мениска фи­ зиологического раствора Хенкса, в принципе одинакова.

При выделении в растворах низкой ионной силы фибриллы ДНП располагаются чаще всего в виде небольших сгустков или комков, от которых на большие расстояния (до нескольких мик­ рон) могут отходить одиночные фибриллы. Такие фибриллы обла­ дают перовным контуром, часто изогнуты и имеют узелковые утолщения. Эта неправильность в контурах фибрилл и дает сред­ нюю толщину около 200 А, хотя встречаются участки толщиной по

250 или 180 А (табл. 1).

Внутренняя структура таких фибрилл более или менее одно­ родна, хотя иногда в них видна пеясно выраженная субструктура в виде неправильно извитых тонких нитей или гранул. Более от­ четливо подобная субструктуризация обнаруживается при негатив­ ном контрастировании. В этом случае контур отдельных фибрилл ДНП неровный, мелкоглыбчатый, хотя разглядеть более подробно их структуру не удается из-за плотной упаковки этих мелких глыбок, имеющих размер 20—40 А (табл. 2).

Обшая морфология препаратов ДНП, выделенных из ядер пе­ чени крыс, в изотонических условиях была сходной с тем, что мы могли наблюдать при выделении ДНП в растворах низкой ионной силы. Отличием являлось то, что фибриллы ДНП в данном опыте были собраны в плотные группы, тесно прилежали одна к другой. Отдельные вытянутые фибриллы встречались крайне редко, данный препарат представлял собой взвесь небольших (около 0,5—2 мк) хроматиновых сгустков. Диаметр встречавшихся отдельных фиб­ рилл был около 200—250 А, их общий контур, плотность и форма были сходными с тем, что наблюдалось в хроматине в растворах низкой ионной силы.

Помещение ядерных эритроцитов на поверхность водного рас­ твора Хэнкса приводило к их разрыву лишь в редких случаях, ядерная оболочка, как правило, не нарушалась и фибриллы ДНП не освобождались. Поэтому можно было наблюдать фибриллы лишь в периферических участках сильно уплощенных ядер. Хроматин в этих зонах представлен сплошной сложной и плотной трехмер­ ной сетью фибрилл, пересекающихся в различных направлениях. Основной диаметр этих фибрилл составляет около 200—250 А.

Эти наблюдения свидетельствуют о том, что хромосомные фиб­ риллы толщиной 200—250 А являются структурами хроматина, не изменяющими свою морфологию в довольно широких пределах ионных сил (от очень низких до 0,2 М концентрации NaCl), что уже позволяет использовать препараты ДНП в низкой ионной си­ ле для дальнейшего анализа.

Те же в принципе картины можно наблюдать и на ультратонких срезах. Вольфе и Грим (Wolfe, Grim, 1967) проверяли, не

влияют ли заливка и изготовление ультратонких срезов на тол­ щину фибрилл в выделенных на поверхности водного мениска препаратах ДНП. Оказалось, что если пленки ДНП, полученные этим методом, обезвоживать, заключать в заливочные среды и из­ готовлять из них ультратонкие срезы, то в них выявляются глав­ ным образом фибриллы толщиной 200—250 А. На этот размер не влияют методы обезвоживания, не влияет способ разрыва или ли­ зиса клеток. Однако эти авторы обнаружили, что на ультратонких срезах видны и неразрушенные ядра, и именно в таких ядрах толщина фибрилл составляла 100 А. Отсюда сделан вывод, что фибриллы в составе клеточного ядра имеют исходный диаметр около 100 А, который возрастает до 200—250 А при разрыве ядра и выходе фибрилл в окружающую среду за счет налипания на них внутриядерных белков.

Развивая эти же представления, Вольфе (Wolfe, 1968; Wolfe, Grim, 1967) приводит наблюдения о том, что если распластывать на поверхности воды ядра, предварительно фиксированные в забуференном растворе формалина, то выявляются фибриллы ДНП толщиной почти в два раза меньше, чем при получении такого же препарата без предварительной фиксации.

Необходимо отметить, что формалинизация препаратов ДНП не приводит к нарушению их химической композиции, не изме­ няет соотношения в них ДНК и белков, которые становятся устой­ чивыми к действию экстрагирующих агентов (Brutlag et al., 1969). Против представлений Вольфе (Wolfe, 1968) о том, что уве­ личение диаметра фибрилл ДНП связано с адсорбцией на их поверхности белков, освобождающихся при разрыве ядерной обо­ лочки, говорит и тот факт, что при экстракции фракции «ядерного сока» 0,14 М раствором NaCl размер фибрилл в препаратах гомо­ генатов таких ядер остается постоянным, порядка 200 А.

Интересные данные представлены в работе Риса (Ris, 1968). Подтвердив свои старые наблюдения о том, что хелатные агенты вызывают уменьшение диаметра фибрилл ДНП с 250 до 100 А, Рис приходит к выводу, что буферы, используемые при фиксации (фосфатный, веронал-ацетатный и др.), действуют как хелаты. Так, ядра при фиксации формолом в фосфатном буфере имели фибриллы толщиной 100 А, а при фиксации формолом в несвя­ зывающем ионы металла буфере — 250 А. Рис приводит данные, противоречащие наблюдениям Вольфе: при изучении ядер эри­ троцитов freez-etching- методом он наблюдал внутри ядер исклю­ чительно фибриллы толщиной 200—250 А. Видимо, хроматиновые фибриллы толщиной 200 А являются основным классом фибпилл хроматина в ядрах клеток.

Хелатным действием растворов четырехокиси осмия можно объяснить меньший диаметр фибрилл при использовании этого агента как химического фиксатора.