Файл: Ченцов, Ю. С. Ультраструктура клеточного ядра.pdf

30 Интерфазное ядро

При фиксации различных клеток растворами четырехокиси осмия структура ядер и хромосом была одинаковой независимо от способа заключения объектов в среды для ультрамикроскопии. Ядра представляли собой отграниченные хорошо выраженной оболочкой образования, равномерно заполненные короткими от­ резками фибрилл толщиной около 100 А. Длина таких фибрилл на ультратонких срезах редко достигает 800—1000 А, что говорит об их сильно извитом характере. Располагаются эти фибриллы от­ носительно друг друга на расстояниях от 500 до 2000 А, что гово­ рит об их диспергированном состоянии в ядрах клеток таких пре­ паратов.

В клетках, находящихся в состоянии митоза при фиксации Os04, на срезах хромосомы представлены компактными зонами, состоящими исключительно из фибрилл диаметром около 100 А. Расположены эти фибриллы относительно друг друга намного плотнее, чем в интерфазном ядре, расстояния между ними со­ ставляют не более 300—200 А. Фибриллы в таких хромосомах также находятся в сильно изогнутом состоянии, так как не удает­ ся проследить их длину на расстоянии более 800 А. В сечениях хромосом эти фибриллы располагаются совершенно равномерно, заполняя весь объем хромосомы. Никаких подразделений в теле хромосомы на структуры более высокого порядка, чем фибриллы толщиной 100 А, не наблюдается.

При фиксации клеток растворами глютарового альдегида об­ щая морфологическая картина организации ядер несколько иная. В этом случае постоянно выявляются зоны конденсированного хроматина в виде узкой полоски около ядерной оболочки, встре­ чаются участки конденсированного хроматина в зоне ядрышка

ив толще ядра — хромоцентры (см. табл. 10).

Вэтом случае основным компонентом, входящим как в участ­ ки конденсированного, так и диффузного хроматина, являются фибриллы толщиной около 200 А, обладающие заметной субструк­ турой. Часто видно, что такие фибриллы имеют в своем составе более тонкие фибриллярные образования, однако подсчитать их число и определить порядок расположения в отдельных фибрил­

лах толщиной около 200 А очень трудно из-за случайного их се­ чения на срезах. В ряде случаев удается увидеть в них правиль­ ную, возможно спиральную, укладку этих субфибрилл, обладаю­ щих толщиной около 50 А (см. табл. 2).

Та же картина наблюдается и в хромосомах, которые на ста­ дии метафазы имеют вид плотных образований, сплошь состо­ ящих из фибрилл около 200 А диаметром (см. табл. 2). Структура этих фибрилл такая же, как и в конденсированных участках хрома­ тина интерфазных ядер.

Видимо, при изучении не только элементарных фибрилл, но и структуры хромосом в интерфазном ядре или при митозе нужно

0s04.

Значительные изменения структуры элементарных хромосом­ ных фибрилл происходят при действии заведомо хелатных соеди­ нений, таких как ЭДТА или цианиды, как это впервые показано Рисом (Ris, Chandler, 1963).

Действительно, при добавлении к растворам ДНП ЭДТА в концентрации 1 -10 —2 М можно видеть, что большую часть препа­ рата составляют тонкие фибриллы (100 А), которые кажутся не только вдвое тоньше исходных, но и гораздо прямее их (табл. 3). Иногда видно, что отдельные фибриллы толщиной 100 А идут на некоторых расстояниях параллельно друг другу, иногда они располагаются попарно. Однако большей частью фибриллы лежат независимо, переплетаясь в различных направлениях. Мы не смо­ гли наблюдать расщепление одной фибриллы толщиной 250 А на две спирально скрученные субъединицы, как указывал Рис. Пар­ ное расположение фибрилл толщиной 100 А, на наш взгляд, яв­ ляется случайным и поэтому не может служить доказательством многонитчатости основной фибриллы, имеющей толщину около

200 А.

Подобное же изменение толщины фибрилл можно вызвать другим агентом, связывающим двувалентные катионы и давно используемым для разрыхления ядерных структур и хромосом,— цианистым калием. Добавление к растворам ДНП KCN в концент­ рации 0,02—0,002 М приводит к уменьшению диаметра фибрилл хроматина до 100 А. Те же картины можно получить и в целых клетках корешков растений при инкубации их в растворах с хе­ латными агентами (ЭДТА или KCN).

Таким образом, два различных вещества, ЭДТА и KCN, обла­ дающие свойством связывать двувалентные катионы, вызывают сходные морфологические изменения в ультраструктуре элемен­ тарных хромосомных фибрилл! Это может служить подтвержде­ нием очень важной роли двувалентных катионов в поддержании общей структуры хроматина (Steffensen, 1960) и одновременно должно настораживать при анализе тех работ, где ЭДТА исполь­ зуется при выделении ДНП.

Резкие структурные изменения происходят с фибриллами ДНП при повышении ионной силы растворов.

Известно, что обработка ядер или хроматина высокими кон­ центрациями NaCl (1—2 М) приводит к растворению хроматина в результате его диссоциации на белок и ДНК (Pollister, Mirsky, 1946). Постепенное повышение концентрации соли в растворе приводит к последовательной диссоциации нуклеогистонового комплекса, что в свою очередь вызывает уменьшение толщины ис­ ходных фибрилл ДНП (Георгиев и др., 1967) и увеличение мат­ ричной активности хроматина (Боннер, 1967).

изучения препаратов ДНП, нри постепенном повышении концен­ трации NaCl в растворе первые изменения в толщине и конфигура­ ции фибрилл начинают обнаруживаться в растворах 0,4 М NaCl и особенно отчетливо в 0,6 М растворах. При этом фибриллы ДНП утоньшаются, их диаметр колеблется от 100 до 40—50 А. Меняет­ ся их пространственная композиция. Если в исходных раство­ рах с низкой ионной силой фибриллы ДНП имели извитой харак­ тер, то теперь они выглядят сильно вытянутыми, идущими непре­ рывно на большом расстоянии (табл. 3). Иногда на их поверхно­ сти видны мелкие гранулы, придающие фибриллам четковидный характер.

Дальнейшее повышение концентрации соли в растворах NaCl (0,8—1,5 М) приводит к преобладанию в препаратах нитей тол­ щиной 30—40 А, также располагающихся главным образом пря­ молинейно.

Очевидно, в данном случае наблюдается структурный переход от плотных сильно изогнутых и перевитых фибрилл с толщиной 200 А к фибриллам меньшего диаметра, вытянутым и более рас­ прямленным. Этот переход связан с потерей белка.

Было замечено (Сенченков, Манамшьян, 1970), что при соле­ вой экстракции фибрилл ДНП, нанесенных на подложку, их дис­ социация происходит не полностью. Под электронным микроско­ пом видно, что в таком препарате, обработанном 2 М раствором NaCl, содержатся участки практически не измененных фибрилл толщиной около 200 А одновременно с тонкими фибриллами. Это наводило на мысль, что при обработке солевыми растворами не весь препарат подвергается диссоциации, а только, по-видимому, та часть, которая не прикреплена к формваровой подложке и до­ ступна для воздействия NaCl. В таких случаях видны практиче­ ски все переходы от фибрилл толщиной 200 А до тонких фибрилл толщиной 20—40 А.

Короткая экстракция солевыми растворами путем быстрого прикасания препарата ДНП к поверхности 2 М раствора NaCl с последующей быстрой фиксацией в формалине дала новые инте­ ресные результаты при использовании негативного контрастиро­ вания препаратов водными растворами уранилацетата или фос­ форновольфрамовой кислоты.

На некоторых препаратах видно разворачивание толстых (200 А) фибрилл (табл. 4). При этом в их составе обнаруживается одна фибрилла толщиной около 100 А, уложенная в виде крутой спирали.

В экспериментах по воздействию растворами высокой ионной силы на ДНП особенно видно изменение толщины фибрилл в про­ цессе экстракции и изменение их общей формы. Действительно, если в исходных растворах фибриллы имели изогнутый, извитой