Файл: Методические разработки для практических занятий по биотехнологии лекарственных средств.docx
ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 16.10.2024
Просмотров: 8
Скачиваний: 0
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Учебно-методические разработки для практических занятий по биотехнологии лекарственных средств./ Под ред. В.А. Быкова. - М.: ММА им. И.М.Сеченова, 1993. - 176 с. 2. Биотехнология: Учебное пособие для ВУЗов. В 8 кн./Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. - М.: Высшая школа, 1987. 3. Блинов Н.П. Основы биотехнологии. Издательская фирма "Наука", СПБ, 1995.-600 с. 4. Краткий терминологический словарь микробиолога-биотехнолога. -М.: Наука, 1989. - 136 с. 5. Биотехнология лекарственных средств. Учебное пособие./Под ред. В.А. Быкова и М.В. Далина. — М.: Медбиоэкономика, 1991. - 303 с. 6. Основы биотехнологии: Учебное пособие для высших пед.учеб.заведений /Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 208 с.
Вариант 21
Задание 1. Приведите схему получения экзогенного человеческого интерферона. Опишите ее.
экзогенный человеческий интерферон получают, используя технологию рекомбинантных ДНК.
Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем:
-
– из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды; -
– полученным продуктом трансформируют E. coli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют; -
– каждую группу клонов гибридизируют с ИФН; -
– из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и РНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка; -
– определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН — мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН — кДНК человека.
Далее следуют:
-
– осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим центрифугированием, -
– высаливание интерферона из супернатанта аммония сульфатом, -
– диализ осадка интерферона, -
– растворение интерферона, пропускание раствора через колонку с иммуносорбентом (пришитыми моноклональными антителами). -
– элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном катионообменнике.
После накопления в специальных ферментерах достаточно высокой концентрации клеток их удаляют из ферментера и разрушают (лизируют). В качестве основных методов лизиса используют: осмотический шок, замораживание-оттаивание, гомогенизирование, обработка детергентами. Затем с помощью последовательных процедур фильтрования, центрифугирования, ионообменной хроматографии и гель-хроматографии происходит предварительная очистка ИФН, дающая в итоге прозрачный бактериальный экстракт, в котором ИФН все еще составляет не более 1-2% от общего количества белка. Окончательную очистку препарата проводят на иммуносорбенте с моноклональными антителами к ИФН.
Моноклональные антитела к ИФН » пришивают» к гранулам носителя и помещают в хроматографическую колонку (А). Затем наносят на колонку бактериальный экстракт, содержащий рекомбинантный интерферон. С антителами связывается лишь ИФН, другие же компоненты экстракта, в том числе все бактериальные токсины, свободно проходят через колонку и удаляются промывным раствором (В). Для извлечения из колонки адсорбировавшийся на антителах рекомбинантный ИФН через нее пропускают элюирующий буферный раствор, имеющий слабокислую реакцию. При этом связь между молекулами ИФН и антителами нарушается . ИФН переходит с поверхности частиц сорбента в буферный раствор и может быть собран в виде чистого вещества, не содержащего загрязняющих белков.
Бактерии с генами интерферона человека продуцируют специфический белок в количестве 200–250 мкг/л бактериальной суспензии. Кроме E. coli удается получать человеческий интерферон с помощью В. subtilis, способную секретировать синтезируемые белки в окружающую среду (у E. coli они накапливаются в периплазматическом пространстве), а такте с помощью Saccharomyces cerevisiae, растущих на средах с более дешевыми субстратами, на них не действуют фаги, они крупнее бактерий и преинтерферонов. Применяют также культуры бактерий из родов Methylomonas, Pseudomonas, Salmonella. Все названные микроорганизмы конструктивно (не адаптивно) образуют интерфероны, не отличающиеся от природных.
Стремительное расширение использования рекомбинантных ИФН и параллельное сокращение в последнее время применения природных препаратов связано, главным образом, с дефицитом сырья для производства последних (донорская кровь). Однако, на современном уровне рекомбинантные ИФН — это лишь воспроизведенные отдельные субтипы ИФН (продукты) одного гена, что сказывается на потенциале терапевтической активности. Идеальный препарат должен, подобно природному, иметь их физиологически сбалансированное сочетание. [4 стр. 560-562].
Задание 2. Опишите, как подобрать правильные дозировки антигенов при изготовлении ассоциированной вакцины?
ссоциированные вакцины состоят из вакцин разного типа и вырабатывают иммунитет к нескольким заболеваниям. Они еще называются комплексными или поливалентными.
Они могут включать однородные антигены (например, анатоксины) и антигены различной природы (например, корпускулярные и молекулярные антигены, убитых и живых микробов). Антигены в вакцинах содержатся в дозировках, не создающих взаимной конкуренции, чтобы иммунитет вырабатывался ко всем антигенам.
Примеры ассоциированных вакцин:АКДС (ассоциированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина) из столбнячного и дифтерийного анатоксина и коклюшной корпускулярной вакцины; живая ассоциированная полиомиелитная вакцина из штаммов вируса полиомиелита I, II,III типов; гриппозная вакцина из трех штаммов вируса гриппа; менингококковая вакцина из антигенов 4-х серотипов менингококка; живая комплексная вакцина против кори, паротита и краснухи.
Задание 3. При культивировании растительных клеток биотехнолог обеспечил следующие условия: влажность 60-70%, механический способ перемешивания, кроме того он планирует перенести культуру в биореактор большего объема. Нет ли ошибок в его действиях? Ответ объясните.
Задание 4. При производстве вакцин в качестве продуцента антигенного белка можно использовать микробы или культуры клеток млекопитающих. Чем будет обусловлен выбор?
Задание 5. Опишите способы получения убихинона, их преимущества и недостатки. Подробно опишите биотехнологический способ.
Промышленное получение убихинонов. При промышленном производстве Ко Q10 с последующим использованием его в терапевтических целях существует метод его экстракции из тканей животных, но в силу ограниченной доступности источников выделения и низкого содержания в них кофермента этот способ не является основным. Главным образом промышленное получение высших гомологов убихинонов базируется на биотехнологических методах: микробиологическом синтезе, обеспечивающем трансконфигурацию боковой цепи и экстракцию Ко Ql0 из культур растительных клеток. Многие представители микроорганизмов синтезируют убихиноны, причем тип главного Ко Ql0 у микроорганизма имеет таксономическое значение. Богатым источником убихинонов являются бактерии. В связи с этим перспективное направление получения Ко Q10 — использование биомасс бактерий, отходов уже действующих производств. Установлено, что биомасса уксуснокислых бактерий, используемых в промышленности для окисления D-сорбита в L-сорбозу, содержит Ко Ql0 без примеси его гомологов. При этом штамм G. oxydans ВНИВИ-6 продуцирует 5,6 мг/л, а штамм ВНИВИ2 — до 7 мг/л убихинона Q10. В настоящее время разработана технология, при которой одновременно осуществляется биосинтез Ко Q10 и окисление D-сорбита в L-сорбозу, причем при экстракции убихинона Ql0 из отсепарированной биомассы, являющейся отходом производства, выход конечного продукта может достигать 85%. На этом примере можно видеть одну из характерных особенностей биотехнологического получения витаминов и коферментов: возможность создания малоотходных производств. В настоящее время для выделения и количественного определения убихинонов предложен целый ряд методов. Их использование обычно определяется характером биообъекта, наличием сопутствующих веществ, однако любой из методов состоит из следующих основных этапов: экстракция, хроматографическое разделение полученного материала и количественное определение убихинонов.
Способы экстракции убихинонов из биообъектов. Убихиноны легко растворимы в жирах и в большинстве органических растворителей и практически не растворимы в воде. Для их экстракции из биомассы обычно используют различные органические растворители. С целью наиболее полного выделения убихинонов биомассы предварительно дополнительно разрушают, дезинтегрируя с помощью ультразвука, или гидролизуют в щелочной среде. Чаще всего исходный материал предварительно гидролизуют спиртовым раствором щелочи, но иногда применяют и прямую экстракцию из нативных или лиофилизированных тканей. Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки. При омылении разлагается большинство сопутствующих веществ, поэтому убихиноны в дальнейшем легко выделяются хроматографическими методами, но при этом возможно разрушение связанного убихинона и в случае употребления этанольного раствора щелочи замещение метоксильных групп этоксильными. Для прямой экстракции обычно используют смеси этанол/эфир (3:1), хлороформ/метанол (3:1), ацетон. При этом из тканей выделяется большоеколичество липидов, которые затрудняют дальнейшую хроматографию и спектрофотометрию. Для проведения редокс-реакции убихиноны экстрагируют из гомогенатов неполярными углеводородами при низкой температуре в присутствии метанола.
Хроматографические методы выделения убихинонов. От сопутствующих липидов убихиноны отделяют с помощью препаративной колоночной или ТСХ. Для разделения гомологов используют бумажную или тонкослойную хроматографию с обращенной фазой, а также колонки, заполненные порошком полиамида. Один из наиболее часто применяемых методов выделения убихинонов — ТСХ. Как известно, в ТСХ адсорбентом служит тонкий равномерный слой сухого мелкоизмельченного материала, нанесенного на соответствующую подложку . Подвижная фаза движется по поверхности пластинки под действием капиллярных сил. Хроматографический процесс зависит от используемого адсорбента и систем растворителей. После окончания процесса исследуемое вещество элюируют соответствующим растворителем. Количественные методы определения убихинонов. Существует ряд методов количественного определения убихинонов. Для этих целей используют реакции с борогидридами и этилцианацетатом. Реакция с этилцианацетатом является достаточно специфичной, и ее обычно применяют при работе с многокомпонентной смесью. Описаны также газохроматографические и ферментативные методы определения убихинонов. Наиболее распространенный и простой способ количественной оценки убихинонов — спектрофотометрический метод. Характерный максимум поглощения для убихинонов находится в УФ-области (275 нм). При мягком восстановлении убихинон превращается в убихинол, и максимум поглощения смещается до 290 нм, что дает возможность измерять количество вещества, используя различия спектров окисленной и восстановленной форм. Оборудование и техническое оснащение: колба (500 мл) с притертой пробкой, микропипетка, культура штамма Gluconobacter oxydans, ацетон, смесь хлоформ/этанол, система хлороформ/этиловый эфир, пластины «Силуфол», спектрофометр, качалка, хроматографическая камера.
Известны способы получения убихинона-10 при помощи дрожжей из р. р. Сandida, Rhodotorula, Torulopsis, Sporidiobolus, предусматривающие культивирование дрожжей в периодических условиях на глюкозосодержащей среде с дрожжевым и кукурузным экстрактами и минеральными солями в аэробных условиях. Выращивание культур Agrobacterium sрp. на средах, содержащих по 4 % мелассы, сахарозы, кукурузного экстракта, а также минеральные соли, при строгом соблюдении режимов аэрации и перемешивания и регулировании скорости роста бактерий позволяет получать до 200 мг убихинона-10 с 1 л культуральной жидкости при содержании его в клетках до 5,1 мг/г сухой биомассы. Убихинон-10 можно также получать при культивировании дрожжей Trichosporon на отходах переработки древесины. Клетки содержат 0,84 мг кофермента в 1 г сухой биомассы. При способе получения убихинона-10 путем культивирования дрожжей Cryptococcus curvatus изменение состава среды приводит к значительному росту выхода целевого продукта и удешевлению производства. Использование в составе среды дешевого сырья – крупнотоннажного отхода производства – молочной сыворотки, которая служит источником углерода, витаминов, микроэлементов, обеспечивает накопление большого количества биомассы. Молочная сыворотка добавляется в среду в количестве 40 – 56 % по объему. Добавление ее в меньшем или большем количестве приводит к снижению выхода убихинона-10 с 1 л культуральной жидкости за счет снижения выхода биомассы в первом случае и снижения удельного содержания убихинона-10 во втором. Добавление глюкозы в среду в пределах 1,2 – 2,6 % является необходимым условием повышения содержания убихинона-10 в клетках (до 0,2 – 0,5 мг/г СБ), в противном случае на среде только с молочной сывороткой содержание убихинона-10 в них очень низкое, 0,05 мг/г сухой биомассы и менее. Дополнительное введение сернокислого или хлористого аммония 0,05 – 0,3 % необходимо для обеспечения определенного уровня значений рН в пределах 2,7 – 3,2, при котором наблюдается повышение содержания убихинона-10 в биомассе, если концентрация глюкозы в среде находится в вышеуказанных пределах. Введение меньших количеств солей аммония не приводит к должному эффекту, а введение больших количеств солей аммония – нецелесообразно. Снижение рН среды за счет добавления неорганических кислот не приводит к увеличению количества убихинона-10. Добавление этанола 3 – 5 % по объему за 10 – 25 ч до окончания ферментации необходимо для ингибирования роста культуры и повышения удельного содержания убихинона-10 в биомассе. Добавление этанола в меньших количествах является неэффективным, так как этанол быстро окисляется. Добавление его в больших количествах нецелесообразно. Способ получения заключается в следующем. Культуру дрожжей Cryptococcus curvatus выращивают на среде следующего состава, в процентах : молочная сыворотка 40 – 56; сульфат аммония или хлористый аммоний 0,1-0,5; однозамещенный фосфат калия 0,2 – 0,5; сульфат магния 0,05 – 0,1; сульфат железа 0,001; сульфат цинка 0,0001; дрожжевой экстракт 0,1-0,2; рН перед стерилизацией 4,7 – 5,4; вода водопроводная до 6 литров. Ферментацию проводят в ферментёре объемом 10 л с 6 л среды при подаче воздуха 1:2 (V :V), оборотах мешалки 900 – 1000 об/мин, температуре 28 °С. Во время ферментации в культуральную жидкость вносят глюкозу для поддержания концентрации ее в среде на уровне 1,2 – 2,6 %, сернокислый или хлористый аммоний 0,05 – 0,3 %. За 10 – 25 ч до окончания ферментации добавляют этанол 3 – 5 % по объему. Процесс ферментации ведется в течение 65 – 72 ч. В конце ферментации клетки отделяют на центрифуге при 5000 тыс. об/мин. Выход биомассы составляет 60 – 116 г/л с влажностью 70 – 82 %. Определение количества убихинона-10 в биомассе дрожжей проводят по модифицированной методике, описанной для определения кофермента Q10 в биомассе уксуснокислых бактерий. Для выделения фракции убихинонов используют ТСХ на пластинках Силуфол UV-254 в системе гексан:эфир (3:1). Содержание убихинона-10 в биомассе дрожжей составляет 0,2 – 0,5 мг/г сухой биомассы. Общее количество убихинона-10 с 1 л культуральной жидкости составляет 4,7 – 9,67 мг/л.