Правила отбора, хранения и транспортировки патматериала.

Пат.материал – от больного или павшего животного.

Пат. Материал отбирают исходя из патогенеза болезни и тропизма вируса.

Основное требование к отбору пат.материала: вирус в материале должен сохраняться в максимальной концентрации.

ПРАВИЛА:

1. 
   Пр. места (пат мат берут из места возможной локализации вируса, т.е. где развивался патогенез).
   
2. 
   Пр. места (материалы берут во время яркого проявления клин. признаков).
   
3. 
   Правила асептики.
   
4. 
   Пат мат доставляют в лабораторию не позднее 2 часов с момента взятия в термосе со льдом или контейнере со льдом.
   

Виды пат. Материала:

1. 
   От больных животных
   

• 
  Смывы с доступных слизистых оболочек (жёсткими сухими инструментами)
  
• 
  Биологические жидкости
  
• 
  Кровь на 1. Вирусовыделение (только ретровирусы, лейкоз); 2. На получение сыворотки (серологическая диагностика)
  
• 
  Кусочки поражённой кожи (оспа, ящур, кальцивироз, кошачий спид).
  

2. 
   От трупов (кусочки органа 10-20г)
   

-кусочки паренхиматозных органов

-регионарные лимфоузлы

-кусочки поражённых органов.

Подготовка материала к вирусологическому исследованию:

Смыв:

1. 
   Ватно-марлевый тампон, зонд или щёточку омывают в физ. р-ре и отправляют в дез. р-р.
   
2. 
   Полученный смыв или вируссодержащую суспензию центрифугируют при 1500-3000 об/мин.
   
3. 
   Надосадочную жидкость переносят в стерильный флакон, добавляют р-ры антибиотиков и оставляют на контакт 2 часа при комнатной температуре.
   
4. 
   Проводят бактериологический контроль суспензии путём посева на бактериальные пит. среды.
   
5. 
   При отсутствии роста микрофлоры, суспензию используют для дальнейшего вирусологического исследования. При наличии роста микрофлоры, суспензию повторно обрабатывают р-ром антибиотика.
   

Пат. Материал с трупов:

1. 
   Кусочки органов растирают в ступке со стерильным песком до гомогенного состояния.
   
2. 
   Добавляют стерильный физ. р-р в соотношении 1:10 для получения 10% суспензии.
   
3. 
   Суспензию центрифугируют при 1500-3000 об/мин – 20-30 минут.
   
4. 
   Надосадочную жидкость переносят в стерильный флакон, добавляют р-р антибиотиков и делают посев на пит. среду.
   

Меры борьбы с вирусными болезнями

---

Профилактика:

1. 
   Специфическая – направлена на предупреждение определённого вируса:
   

• 
  Вакцинация (актив)
  
• 
  Сыворотка
  
• 
  Серопрофилактика (пассив)
  

2. 
   Неспецифическая – профилактика любой инф. Болезни.
   

• 
  Вет-сан мероприятия (дезинфекция, карантин)
  
• 
  Зоогигиенические мероприятия (уход, кормление, содержание)
  

Использование лабораторных животных в вирусологии

Для обнаружения активного репродуцирующегося вируса в вирусологии используют живые системы.

Живая система – совокупность клеток, чувствительных к конкретному вирусу.

Виды живых систем:

1. 
   Лабораторные животные
   
2. 
   Эмбрионы кур
   
3. 
   Культура клеток
   

Виды ЛЖ:

• 
  Белые мыши
  
• 
  Морские свинки
  
• 
  Кролики
  
• 
  Белые крысы
  
• 
  Золотистые хомячки
  

Био.проба – заражение живой системы.

Цели использования ЛЖ:

1. 
   Индикация (обнаружение) вируса в пат.мат.
   
2. 
   Изоляция (выделение) вируса.
   
3. 
   Идентификация – определение вида вируса.
   
4. 
   Титрование или определение количества вируса.
   
5. 
   Накопление биомассы вируса при изготовлении вакцин.
   
6. 
   Поддержание штаммов вирусов в лаб. условиях путём пассажа.
   
7. 
   Получение гипериммунных сывороток (для серопрофилактики).
   
8. 
   Получение специфической клинической картины болезни (оспы, ящур, в. Болезни Ауески).
   

Пассаж – заражение ЖС с целью получения новой популяции вирусов или восстановления активности вируса при хранении (=биопроба).

Требования к ЛЖ:

1. 
   Животные должны быть здоровыми, из благополучных по инф. Болезням питомников или вивариев.
   
2. 
   Животные должны быть того вида и возраста, который наиболее чувствителен к данному вирусу.
   
3. 
   Животные должны быть линейными (генетически однородными, полученными от одной пары родителей).
   

Биопроба заключается в инокуляции (введение) вируссодержащего материала в организм ЛЖ. Способ заражения зависит от тропизма вируса.

Тропизм – способность вирусов репродуцироваться только в определённых чувствительных к нему клетках организма.

За заражёнными животными наблюдают для обнаружения признаков репродукции:

1. 
   Клинические признаки
   
2. 
   Гибель в определённые сроки (первые 24-48ч неспецифическая гибель)
   
3. 
   От положительной биопробы отбирают вторичный пат мат для дальнейшего вирусологического исследования.
   

Слепой пассаж – заражение ЖС без получения видимых изменений.

---

При исследовании первичного пат мат проводят не менее трёх слепых пассажей.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ В ВИРУСОЛОГИИ

КЭ – оплодотворённое яйцо (21 день).

Перед заражением КЭ овоскопируют для определения жизнеспособности:

1. 
   Хорошо выраженные сосуды ХАО (хорионаллантоисная оболочка)
   
2. 
   Подвижность КЭ, которую определяют по движению глаза.
   

Структуры и функции:

1. 
   Скорлупа (защита)
   
2. 
   Подскорлупная оболочка (защита)
   
3. 
   Воздушная камера (воздухообмен)
   
4. 
   Хорион-аллантоисная оболочка – ХАО (дыхание)
   
5. 
   Аллантоисная полость (выделение)
   
6. 
   Амниотическая полость (физиологическая среда)
   
7. 
   Желточный мешок (питание)
   
8. 
   Белок (запас воды)
   
9. 
   Зародыш
   

Цели использования КЭ:

1. 
   Индикация
   
2. 
   Изоляция
   
3. 
   Идентификация
   
4. 
   Титрование
   
5. 
   Накопление биомассы вируса
   
6. 
   Поддержание штаммов вирусов в лаб. Условиях.
   

Преимущества КЭ:

1. 
   К КЭ чувствительно большое количество вирусов благодаря недостаточному развитию защитных механизмов.
   
2. 
   КЭ не образуют АТ в ответ на введение вируса (но, если птица, от которой получили эмбрион, вакцинирована, то могут быть АТ)
   
3. 
   КЭ практически стерильная ЖС
   
4. 
   Простая для заражения система, не требует кормления, ухода и содержания.
   

Требования к КЭ:

1. 
   Получают от здоровой невакцинированной птицы из благополучных по инф. болезням птицефабрикам
   
2. 
   Скорлупа КЭ должна быть чистой, непигментированной
   
3. 
   Возраст КЭ должен соответствовать тропизму вируса
   

При заражении КЭ учитывают:

1. 
   Тропизмы вирусов (в какую структуру заражать)
   
2. 
   Срок максимального развития данной структуры.
   

• 
  Аллантоисную полость заражают пневмотропными вирусами на 9-11 д инкубации
  
• 
  ХАО – дермотропные – 10-12д
  
• 
  Желточный мешок – вирус ринопневмонии лошадей – 5-7 день
  
• 
  Тело зародыша – пантропные вирусы – 7-14 день
  

Методика заражения КЭ вирусом болезни Ауески в аллантоисную полость (9дней инкубации, доза 0,2-0,3мл)

1. 
   Скорлупу в области воздушной камеры и со стороны противоположной зародышу фломбруют.
   
2. 
   Стерильным пробойником делают 2 отверстия: по центру возд. камеры и на 5мм ниже возд. камеры с противоположной зародышу стороны.
   
3. 
   Вводят 0,2-0,3 мл вируса на всю длину иглы.
   
4. 
   Отверстие закрывают парафином.
   
5. 
   Подписывают
   
6. 
   Инкубируют 5 дней – 37 градусов.
   

---

Индикация вирусов куриных эмбрионов

Заражённые эмбрионы инкубируют и срок инкубации зависит от вида вируса. Зараженные эмбрионы ежедневно овоскопируют.

Гибель эмбриона в первые 24 часа - неспецифическая, такие эмбрионы выбраковывают. В дальнейшем все погибшие эмбрионы до вскрытия помещают на +4 для уплотнения оболочек и снижения вероятности кровотечения при вскрытии.

Признаки репродукции вирусов куриных эмбрионов:

1. 
   Гибель в определённые сроки.
   
2. 
   Патологоанатомические изменения в структурах эмбрионов.
   

Некоторые вирусы не вызывают гибели и патологических изменений куриных эмбрионов. Их индикацию проводят по свойству гемагглютинации.

Гемагглютинация - склеивание эритроцитов в присутствии гемагглютинирующих вирусов.

Гемагглютинирующие вирусы содержат в своём составе гемагглютинин, который взаимодействуют со специфическими рецепторами на поверхности эритроцитов, вызывая их склеивание. Каждый вирус агглютинирует эритроциты определённого вида животных.

• 
  Пример: вирус болезни ньюкасла - эритроциты петуха.
  
• 
  Парагрип-3 КРС - эритроциты морской свинки
  
• 
  Вирус бешенства - эритроциты гуся
  

Индикацию гемагглютинирующих вирусов проводят в капельной реакции гемагглютинации (РГА)! не относится к серологическим реакциям!

Методика индикации вируса болезнь ньюкасла в курином эмбрионе (вскрытие)

1. Скорлупу в области воздушной камеры фламбируем.

2. Ножницами срезают скорлупу по границе воздушной камеры.

3.Прорывают под скорлупную оболочку и ХАО и наконечником отбирают одну каплю аллонтоисной жидкости и помещают её на керамическую плитку.

4. Добавляют одну каплю 5% взвеси эритроцитов петуха, перемешивают, контакт 5 мин при комнатной температуре.

Если вирус репродуцировался, то прошла гемагглютинация. Видна как хлопья эритроцитов на фоне просветления жидкости.

Использование культуры клеток в вирусологии

КК - клетки многоклеточного организма, живущие и делящиеся вне организма.

Цели использования - как у куриных эмбрионов.

Преимущества КК:

1. 
   Отсутствие видового ограничения для культивирования вирусов.
   
2. 
   Возможность вмешательства в инфекционный процесс на любой его стадии.
   
3. 
   Культуральная жидкость является стерильной вирусодержащей суспензией.
   

---

Классификация культур клеток:

I. По продолжительности жизнеспособности:

1. 
   Переживающая(клетки не делятся и сохраняют жизнеспособность ограниченное время)
   
2. 
   Растущая культура клеток(клетки делятся и сохраняют жизнеспособность определённое время)
   

• 
  Культура ткани
  
• 
  Культура клеток
  

II. По способу культивирования:

1. Многослойные стационарные КК(клетки прикреплены к поверхности культурального флакона (КК матрас) и делятся на три вида:

• 
  -первично трипсинизированное(получают из органов животного)
  
• 
  -диплоидная(морфологически однородные клетки, полученные из первичной и стабилизированные в процессе культивирования);
  
• 
  -перевиваемые(клетки, полученные из первичной или диплоидной КК спонтанно или искусственно и способные к делению вне организма не ограниченное время)
  

2. Суспензионные КК(клетки прикреплены на носитель Или микро носитель и в культуральном флаконе находится в виде взвеси).

Методика получения первично-трипсинизированных клеток

Принцип основан на том, что кусочки ткани здорового животного расщепляют протеолитическими ферментами на отдельные клетки. От здорового животного (лучше эмбрион) не позднее 2 часов с момента убоя выделяют орган (почки, лёгкие, сосуды, железы).

1. 
   Кусочки органы измельчают ножницами и отмывают от крови и слизи солевыми растворами.
   
2. 
   Кусочки переносят в колбу с магнитом + 0,25% тёплый раствор трипсина и помещают в магнитную мешалку.
   
3. 
   Дробная трипсинизация( трипсин в начале расщепляет белки межклеточного вещества; отдельные белки накапливаются в растворе и жидкость мутнеет. Полученные клетки переносят в стерильный раствор на +4. К оставшимся кусочкам органа добавляют трипсин и процедуру повторяют до полного истощения ткани).
   
4. 
   Полученные клетки центрифугируют при 1000 об\мин - 10-15мин. Надосадочную жидкость удаляют.
   
5. 
   Количество клеток подсчитывают в камеру горлева и доводят до 10 в 6ст кл\мл.
   
6. 
   Клетки помещают в матрас, добавляют ростовую питательную среду и культивируют при 37°.
   

Метод наблюдения за КК - световая микроскопия.

Растворы для КК:

1) солевые растворы:

• 
  -р-р Хэнкса
  
• 
  -р-р Эрла
  

Смеси Солей + Глюкоза. Используют как основу для приготовления питательной среды и для манипуляций на Культуре клеток.

2) диспергирующие растворы:

• 
  -0,25% р-р трипсина
  
• 
  -0,002% р-р версена
  

Используют для первичной трипсонизации и для снятия клеток с поверхности матраса.

---

Смотрите также файлы

• Понятие и виды гражданскоправовой ответственности.docx

• Конкурс педагогических проектов по формированию, развитию и оценке функциональной грамотности обучающихся основной школы 2021.docx

• Методика проведения баночного массажа.doc

• Тема Защита населения в чрезвычайных ситуациях Чрезвычайные ситуации мирного времени.pdf

• Конспект викторины (форма) по теме Книга сказок.docx