3) питательные среды

• 
  -ср Игла
  
• 
  -ср 199
  

По функциям:

• 
  -поддерживающая
  
• 
  -ростовая (+10% сыворотки крови КРС).
  

Индикация вирусов в КК

Методика заражения КК (биопроба)

1. 
   Подготовительный (для заражения используют КК с полным монослоем и типичной морфологией клеток). Оставляют 5-10 матрасов с незараженной КК в качестве контроля.
   
2. 
   Биопроба
   

• 
  Из всех матрасов удаляют ростовую среду
  
• 
  вносят вирусную суспензию в заражающей дозе (контакт 1 час 37°)
  
• 
  Вирусную суспензию удаляют и вносят в поддерживающую среду
  
• 
  Культивируют при 37°, ежедневно на микроскопируя для выявления признаков репродукции вируса.
  

1) индикация вируса по цитопатическому действию (ЦПД) - это любые изменения на слоя или морфологии клеток под действием вируса. Обнаруживают методом световой микроскопии, сравнивая зараженную культуру клеток с контрольной. Любые отличия заражённой КК являются признаками ЦПД. ЦПД обнаруживают по площади изменённого на слоя или по изменению морфологии клеток (округление клетки, фрагментация, образование симпласта).

2) индикация вирусов по реакции гемадсорбции (РГАд)

Гемадсорбция - адсорбция (присоединение) эритроцитов определённого вида на клетках, заражённых вирусом.

Формы существования вирусов

Вирусы могут существовать в 2 формах:

1. 
   Внеклеточная (зрелый неактивный вирус) - вирион.
   
2. 
   Внутриклеточная форма
   

• 
  Активный репродуцирующийся вирус на любой стадии
  
• 
  Провирус (когда вирусный геном интегрирован в геном клетки хозяина и длительное время персистирующий без клинических признаков в нём)
  
• 
  Дефектные интегрирующие частицы (ДИЧ). Дефектные по генетическому материалу вирусы, у которых отсутствует информация о Белках и ферментах, необходимых для репликации вирусного генома.
  

Индикация вирусов по вириону - вирусоскопия

1. 
   Световая микроскопия (-позволяет обнаруживать вирусы только очень крупного размера(оспы); + доступность).
   
2. 
   Электронная микроскопия (- получают электронные микрофотографии, по которым можно определить критерии рода (форма вириона, размер вириона, тип симметрии, наличие суперкапсидной оболочки).
   

Индикация вирусов по тельцам включения

Некоторые вирусы во время репродукции образуют структуры (тельца-включения). Их обнаружение позволяет говорить о включении вирусов в клетку. Метод обнаружения: световая микроскопия.

---

Классификация

1. По происхождению и составу:

• 
  Клеточного (скопления структур клеток на ранних стадиях репродукции)
  
• 
  Вирусные (скопление компонентов вируса или отдельных вирионов, не покинувших клетку на поздних стадиях)
  
• 
  Смешанные (скопления структур клеток и компонентов вируса)
  

2. По локализации:

• 
  Ядерные ( ДНК-геномные) пр оспа днк геномная, образует тел.вкл.
  
• 
  Цитоплазматические (РНК-геномные)
  

3. По отношению к красителю:

• 
  Оксифильные в красный
  
• 
  Базофильные в синий
  

Тельца включения примеры:

• 
  Вирус бешенства - тельца Бабеша-Негри
  
• 
  Вирус чумы плотоядных - т Лентуа
  
• 
  Вирус оспы овец - т Боррелиа
  
• 
  Вирус оспы птиц - т Боллингера
  
• 
  В.инф ларинготрахеита птиц - т Зейфреда
  

Титр – количество вируса в единице объема материала.

Метод определения вируса – титрование.

Цели:

1. 
   Определение рабочей дозы вируса для серологич. Р-ии.
   
2. 
   Определение активности противовирусных вакцин.
   
3. 
   Контроль активности вируса при хранении.
   
4. 
   Постановка биопробы
   
5. 
   Получение гиперимунных сывороток.
   

Титр вируса определяют по эффекту или эффективности его действия в какой-либо системе. 2 вида эффективности действия вируса:

• 
  Инфекционной активностью обладают все вирусы
  
• 
  Гемагглютинирующая активность
  

Инфекционную активность вируса определяют по инфекционному титру методом титрования в живой чувствительной системе, где единица измерения 1 ЭД50(эффективная доза 50 – такая доза вируса, которая при введении чётному количеству ЖС, вызывает эффект в 50% случаев).

Инфекционный титр – количество ЭД50 в 1мл вируссодержащего материала. ИЛИ то число, во сколько раз развели вирус, чтобы получить одну ЭД50.

Инфекционный титр одного и того же вируса зависит от живой системы, в которой титруют вирус и от эффекта, по которому титруют вирус.

ЛЖ: летальность – ЛД50; кл.пр и пат.ан.изм – ИД50.

КЭ: летальность – ЭЛД50; пат.изм – ЭИД50; локальн.изм – ООЕ

КК: пат.изм – ЦТД50; локальн.изм – БОЕ.

Определяют инф титр вируса по методу Кербера:

1. 
   Приготовление 10вХ разведений вируса
   
2. 
   Каждым разведением вируса заражают по 4 КЭ по 0,2 мл
   
3. 
   Учёт результатов (+ КЭ пал).
   

+ МЕТОД Рида и Менча по локальным повреждениям.

Титрование вирусов по ГА-активности

---

ГА вирусы обладают ГА-активностью, которую определяют по ГА-титру методом титрования в количественной р-ии агглютинации.

1 ГАЕ – гемагглютинирующая единица.

За 1 ГАЕ принимают такую дозу вируса, которая вызывает ГА не менее, чем на 2 креста.

Этапы ГА:

1. 
   Адсорбция вирусов на поверхности Э засчёт взаимодействия вирусного белка ГА со специфическими рецепторами на поверхности клетки Э.
   
2. 
   Склеивание Э засчёт образования между ними мостиков из вирусов.
   
3. 
   Элюция (деабсорбция) – сползание вирусов с поверхности Э засчёт разрушения рецепторов Э.
   

РГА – обратимая. Есть качественная(капельная) только для индикации ГА-вирусов. Количественная только для определения ГА-титра вируса.

Компоненты: физ.р-р, Вирус, 1% взвесь Э петуха.

Использование серологических реакций в вирусологии

Серологические р-ии – р-ии между генетически чужеродным агентом – АГ и специфическими белками – АТ, с образованием комплекса АГ-АТ.

Задачи, решаемые с помощью серологическими р-ями:

1. 
   Индикация вируса в первичном пат мат.
   
2. 
   Идентификация выделенного вируса.
   
3. 
   Обнаружение АТ в сыворотке крови.
   
4. 
   Определение титра АТ.
   

Источник АГ – вирусные белки.

РИФ(МФА) – серологическая р-ия, основанная на том, что специфические АТ, соединённые с флюорохромом сохраняют способность вступать в специфическое взаимодействие с гомологичными АГ с образованием комплекса АГ-АТ, который обнаруживают по характерному свечению в люминесцентном микроскопе.

Признак положит РИФ – свечение.

Прямой вариант: исследуемый материал + специфический конъюгат=свечение в люминесцентном микроскопе (комплекс АГ-АТ). Используют для индикации и идентификации вирусов.

Непрямой вариант: исследуемый мат. + специфический конъюгат= комплекс АГ-АТ +антивидовой конъюгат= свечение. Используют для индикации и идентификации вирусов, обнаружение и определение титра АТ.

Конъюгат – АТ+ любая метка.

Антивидовая сыворотка – сыворотка, содержащая АТ против белков сыворотки крови того вида животного, которое было донором специфической сыворотки. + любая метка = антивидовой конъюгат.

Достоинства р-ии: экспресс-метод; обладает высоко й специфичностью; не требует стерильности компонентов.

ОООООООООООООООООООООООООООООО

---

РДП (р-ия диффузионной преципитации) – серологическая р-ия, основанная на том, что АГ и АТ , помещённые в лунки агарового геля диффундируют в нём в разных направлениях и, если они гомологичны друг другу между ними образуется комплекс АГ-АТ, который обнаруживают по белой линии преципитации.

За титр АТ в РДП принимают наибольшее разведение сыворотки, ещё дающее линию преципитации.

Достоинства РДП: экспресс-метод, высокая специфичность метода, не требует стерильности компонентов; низкая чувствительность.

ООООООООООООООООООООООО

РН- серологическая р-ия, основанная на взаимодействии АГ активного вируса с АТ сыворотки крови с обр. комплекса АГ-АТ, в которой вирус утрачивает свою инфекц. Активность.

Индикатором свободного несвязанного вируса является чувствительная к нему живая система. При образовании комплекса АГ-АТ живая система не заражается, т.к защищена АТ сыворотки крови.

Пр-ак + РН отрицательная биопроба.

1 этап сыворотка с АТ. АГ + АТ = АГ-АТ

2 этап биопроба на ЛЖ,КК,КЭ.

Цели использования: идентификация, обнаружение и определение титра АТ.

За титр АТ в РН принимают наибольшее разведение сыворотки, которое защищает от действия вируса 50% ЖС.

Достоинства РН: эталонная по специфичности реакция.

Недостатки: не экспресс-метод; требует стерильности комп.; трудоёмкая, длительная, дорогостоящая.

ООООООООООООООООООООООООООО

РНГА

Принцип 1 варианта: Э, на которых стабильно и необратимо адсорбированы специф. Вирусные АГ приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфич. Гомологичных АТ. Используют для обнаружения и определения титра АТ. ЭрАГ+АТ=ЭрВАТ

Принцип 2 варианта: Э, на которых стабильно и необратимо адсорбированы специф. противоВирусные АТ приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфич. Гомологичных АТ. ЭрАТ+АГ=ЭрАТ

Компоненты: физр р, сыворотка, эритроцитарный АГ диагностикум.

За титр АТ в РНГА – наибольшее разведение сыворотки, дающее ГА не менее, чем на 2 креста.

Пр-ак + зонтик

Этапы изготовления эритроцит. Диагностикумов:

1. 
   Подготовка Э. получают из баранов, птиц, людей (искл. Для болезней людей) и консервируют р-р формалина или акрола.
   
2. 
   Ранизация эритроцитов. Обрабатывают дубильными в-вами, оболочка Э уплотняется и сморщивается, приобретая большую сорбционную ёмкость (способность адсорбировать белки).
   
3. 
   Сенсибилизация (повыш чувствительности). Фиксируют специфические вирусные белки или АТ.
   

---

Достоинства РНГА: экспресс; не тр стерильности; высокая чувствительность и специфичность; простая техника.

Недостаток: сложность в изготовлении диагностикумов.

ОООООООООООООООООООООО

Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд) основана на взаи­модействии расположенных на поверхности зараженных клеток анти­генов гемадсорбирующих (вызывающих адсорбцию эритроцитов на поверхности зараженных клеток) вирусов со специфическими анти­телами. При этом блокируется гемадсорбирующая активность вируса. Индикатором в реакции торможения гемадсорбции являются эри­троциты определенного вида животных.

РТГАд преимущественно используют для идентификации вируса и редко — для обнаружения и титрования антител.

Для идентификации вируса последовательные двукратные разве­дения вируса вносят в лунки планшета с культурой клеток. После контакта добавляют специфическую сыворотку в постоянной рабочей концентрации. На втором этапе вносят индикатор — 0,5 —1%-ю взвесь эритроцитов, которые после контакта удаляют физиологиче­ским раствором. Реакцию учитывают методом световой микроскопии по отсутствию адсорбированных на клетках эритроцитов.

Реакция имеет ограниченное применение, поскольку может быть использована только для гемадсорбирующих (гемагглютинирующих) вирусов, не является экспресс-методом и трудоемка.

ООООООООООООООООООООО

РТГА – серолог реакция на взаимодействие ГА вируса с АТ сыворотки крови, с образованием АГ-АТ, в котром вирус утрачивает ГА-активность. Э не склеиваются, т.к. вирус теряет способность адсорбироваться на Э и ГА тормозится.

Пр-ак + пуговка

Индикатором свободного вируса является чувствительность к Э.

1 эт: АГ+АТ = АГ-АТ

2ЭТ: АГ-АТ + ЭР = пуговка

За титр принимают наибольшее разведение сыворотки, полностью тормозяящее ГА.

Титр должен иметь 4ГАЕ.

Достоинство РТГА: не требует стерильности; высокая специфичность; простая постановка

Недостаток: только для ГА-вирусов.

ООООООООООООООООООООО

Иммунно-ферментный анализ (ИФА) - серологическая р-ия, основанная на том, что АТ, соединённые с ферментной меткой – конъюгат – вступают в специфическое взаимодействие с гомологичным АГ с образованием комплекса АГ-АТ, в который встраивается ф-т и добавление к комплексу ф-та чувствительного в-ва (субстрата) приводит к образованию цветного продукта ферментативной р-ии.

ИФА: 1. специфическая фаза – сама иммунная реакция(образование АГ-АТ); 2. Неспецифическая – ферментативная р-ия, которая позволяет увидеть и измерить результат.

---

Смотрите также файлы

• Понятие и виды гражданскоправовой ответственности.docx

• Конкурс педагогических проектов по формированию, развитию и оценке функциональной грамотности обучающихся основной школы 2021.docx

• Методика проведения баночного массажа.doc

• Тема Защита населения в чрезвычайных ситуациях Чрезвычайные ситуации мирного времени.pdf

• Конспект викторины (форма) по теме Книга сказок.docx