Файл: Хокс П. Электронная оптика и электронная микроскопия.pdf

Объект чаще всего утоняется до необходимой конечной толщины, требуемой для просвечивающей электронной микроскопии, способом электролитической полировки, при котором поверхностные слои последовательно уда­ ляются путем электролиза. Другим довольно эффектив­ ным и интересным способом утонения на второй стадии является ионная бомбардировка, в процессе которой поверхностные слои атомов целиком удаляются с образца. Для осуществления такого способа можно применять пучки ионов аргона или других элементов. Величина ионного тока при этом обычно составляет десятки и сотни микроампер. Ионную бомбардировку с целью утонения можно проводить непосредственно в самом электронном микроскопе, что наряду с утонением обеспечивает также возможность очистки исследуемого образца от различных загрязнений.

Тонкие слои можно выращивать также путем испаре­ ния и последующего осаждения атомов исследуемого вещества на соответствующую подложку. Выбор подложки очень важен, так как ее кристаллическая структура влияет на строение осажденного слоя атомов. Этот эффект, извест­ ный под названием эпитаксии, позволяет выращивать тонкие слои с заранее заданными кристаллическими ориен­ тациями. В качестве материала для подложек в настоящее время широко применяются слюда и хлорид натрия. Например, при использовании слюды плоскость естест­ венного раскола оказывается прочно связанной с отдель­ ным набором плоскостей кристаллической решетки, а именно с плоскостями (001). Если на слюде осаждается серебро в условиях, когда температура слюды поддержи­ вается в оптимальном для этой цели интервале 250— 300° С (определяется экспериментальным путем), то слой серебра будет расти таким образом, что плоскости (111) окажутся параллельными плоскости раскола слюдяной подложки. Приведенный пример имеет важное практиче­ ское значение, так как аналогичным способом можно выращивать более благородные металлы на серебре, кото­ рое затем удаляется путем растворения в азотной кислоте.

Подлежащее исследованию вещество помещается в лодочку или тигель, которые нагреваются электронагрева­ телем. Исследуемое вещество можно также нагревать

путем бомбардировки электронным пучком. Преимущество такого способа нагрева состоит в том, что в этом случае устраняется возможность загрязнения испаряемого веще­ ства материалом тигля (поскольку электронный пучок направляется непосредственно на испаряемую часть соот­ ветствующим образом закрепленного материала). Имеется также возможность одновременного испарения несколь­ ких химических веществ, благодаря чему можно вырастить тонкий слой сплава или твердой смеси.

6.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

Препарирование биологических материалов для элек­ тронной микроскопии представляет собой длительный, сложный и трудоемкий процесс. Живые ткани, состоящие большей частью из воды и легких химических элементов, должны быть превращены в твердые объекты, выдерживаю­ щие низкие давления и облучение электронным пучком и содержащие достаточно тяжелые атомы, способные вызвать заметное рассеяние электронов. Целью описывае­ мых ниже способов является проведение указанного процесса превращения исследуемых материалов таким путем, чтобы объекты во время препарирования повреж­ дались как можно меньше. Короче VoBopn, задача сводит­ ся к получению вместо мягкого, влажного 'вещества, состоящего большей частью из легких атомов, твердого сухого материала, содержащего тяжелые атомы, прочно связанные со сверхструктурными компонентами исследуе­ мого вещества. (Под сверхструктурой понимается тонкая структура биологических материалов, детали которой недоступны для наблюдения в световом микроскопе.)

Основными стадиями препарирования биологических объектов из тканей животных или растений являются фиксирование, заливка, микротомирование и окрашивание. Ниже в основном рассматриваются именно эти стадии. Некоторые объекты, например вирусы, по своей природе слишком малы для того, чтобы можно было рассматривать в микроскопе отдельный вирус. Методы их препарирова­ ния, довольно значительно отличающиеся от методов препарирования большинства биологических материалов, описаны в разд. 5.2.2.

5.2.1.ЗАЛИВКА БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

ИПОЛУЧЕНИЕ СРЕЗОВ

Фиксирование. Обычно возникает задача исследования структуры отдельного органа. Для этого необходимо по возможности быстрее отсечь от него определенную часть и поместить ее в специальное фиксирующее вещество. Целью фиксирования является сохранение составных частей ткани в том положении, которое они занимали в живом органе, а также их защита от разрушения (напри­ мер, вследствие ферментативного расщепления). Для фик­ сирования биологических материалов обычно применяют четырехокись осмия 0 s 0 4, формальдегид и глутаральдегид. Если не принять никаких мер предосторожности, то вследствие воздействия фиксирующего вещества и других химических реагентов может измениться величина pH объекта, что отрицательно повлияет на его сохранность. Для предотвращения этого в фиксирующее вещество добавляется специальное буферное вещество, препятствую­ щее изменению pH исследуемого объекта. В качестве буферных веществ используются различные вещества, выбор которых зависит от величины pH, однако по составу все они близки к нейтральным соединениям. Во многих случаях целесообразно применять фосфаты, например

вещество, температура которого обычно поддерживается в пределах 0—4 “С в течение примерно 30—60 мин. Однако некоторые органеллы (определенные виды микротрубочек) сохраняются только в тех случаях, когда фиксирование осуществляется при комнатной температуре. После фик­ сирования в глутаральдегиде объект погружается при­ мерно на 1 ч в четырехокись осмия. Фиксирование в глу­

эффективных и целесообразных методов, используемых при препарировании биологических материалов. Вслед за послефиксированием объект промывают в растворе буферного вещества или в 50%-ном ацетоне, чтобы предот­ вратить выпадение в осадок осмия при дальнейшем обез­ воживании объекта спиртом.

286 Глава 5

Очень важно иметь достаточное количество независи­ мых контрольных методов, позволяющих удостовериться в том, что конечное изображение, видимое в электронном микроскопе, соответствует истинной структуре исследуе­ мого объекта, а не артефактам, случайно появившимся в процессе препарирования. Одним из таких контрольных методов является фиксирование отдельного образца иссле­ дуемого материала не химическим, а физическим путем, а именно замораживанием. Этот метод фиксирования сам по себе представляет большой интерес. Отрезанную часть живой ткани охлаждают очень быстро таким обра­ зом, что содержащаяся в нем вода превращается не в кри­ сталлический лед, а в твердую стеклообразную массу. Это достигается благодаря тому, что при достаточно быстром понижении температуры молекулы воды не успе­ вают расположиться в порядке, соответствующем кристал­ лической структуре льда, а остаются в тех же случайных положениях, характерных для обычной воды. Скорость охлаждения является очень важной величиной: напри­ мер, при 1,6 К/мс образуются довольно крупные кристал­ лы, в то время как при 8,3 К/мс образуется преимущест­ венно стекловидная масса. Стекловидная масса удаляется затем путем возгонки при низкой температуре.

После химического фиксирования объект может быть подготовлен для дальнейшей стадии препарирования (заливки) двумя способами. Если применяемое для залив­ ки вещество нерастворимо в воде, но растворяется в спирте, то объект с целью удаления из него воды последовательно погружают в ряд ванн со спиртом (обычно этиловым), расположенных в порядке увеличения концентрации. Часто объект погружают примерно на 30 мин в окись пропилена, так как это облегчает его пропитку заливоч­ ным веществом, растворяющимся в этом органическом растворителе. При использовании заливочного вещест­ ва, растворимого в воде, необходимость в описанной

центрации раствора заливочного вещества в воде, начи­ ная от 50%.

Заливка. После проведения указанных выше операций исследуемый объект подготовлен для заливки. В каче­ стве заливочного вещества обычно используют различные эпоксидные смолы, в частности аралдит (ароматическая смола), эпон (алифатическая смола) и вестопал, представ­ ляющий собой полиэфир. Ни один из этих полимеров не растворяется в воде, и если заливке эпоксидной смолой предшествует погружение в окись пропилена, то объект до обработки чистым заливочным веществом погружают на 30 мин в смесь, состоящую из равных частей заливоч­ ного вещества и окиси пропилена. При использовании вестопала проводится обезвоживание ацетоном, а окись пропилена заменяется стиролом. В качестве заливочного вещества широко применяются также такие растворимые в воде вещества, как дюркупан (эпоксидная смола) и гликольметакрилат (2-оксиэтилметакрилат), который являет­ ся мономером.

Естественный процесс полимеризации этих различных заливочных сред происходит очень медленно. В связи с этим при заливке применяется специальный состав для ускорения процесса (в случае применения эпона таким ускорителем является бензилдиметиламин). Если заливке подлежит слишком мягкий объект, то при приготовлении тонких срезов могут происходить их разрывы. Чтобы избежать этого, в заливочное вещество добавляют спе­ циальные отвердители, например ангидрид додеценилянтарной кислоты или ангидрид гексагидрофталевой кислоты.

Заливочное вещество и пропитанный объект помещают затем в отдельные небольшие сосуды. Для этого обычно широко применяются желатиновые капсулы, в которых заключены таблетки соответствующего соединения. Эти капсулы дешевы и имеют очень удобную форму. Можно использовать также пластмассовые капсулы, торцы кото­ рых имеют форму усеченной пирамиды. Преимущество этих капсул состоит в том, что их применение позволяет облегчить проведение следующей стадии процесса препа­ рирования — стадию получения тонких срезов с помощью микротома. Капсулы для полимеризации помещают при­ мерно на 3 дня в печь, в которой поддерживается темпера­ тура 60 °С. Хорошее заливочное вещество должно обла­ дать следующими свойствами: быстрой восприимчи-

288 Глава 5

востью органическими веществами; низкой вязкостью, обеспечивающей его проникновение в мельчайшие поры и трещины; равномерным затвердеванием, исключающим возможность деформации препарируемого объекта; затвер­ девшая масса должна быть достаточно плотной для того, чтобы ее можно было резать микротомом, и достаточно устойчивой к действию электронного луча. Кроме этого, желательно также, чтобы капсула не обладала никакой собственной структурой. Большинство заливочных сред подобно стеклам, состоящим из хаотически расположен­ ных упорядоченных структур. Эти структуры оказались самыми мелкими у аралдита (~0,7 ми), затем следуют вестопал (1 нм), эпон (1,2 нм) и метакрилат (1,8 нм). При выборе заливочного вещества для конкретного препари­ рования следует учитывать все перечисленные выше фак­ торы.

Микротомия. После заливки исследуемый объект ока­ зывается залитым в небольшой блок из эпоксидной смолы длиной около 10 мм. Один конец блока заостряют и вруч­ ную закрепляют в небольшом зажиме, после чего с дру­ гого конца блока срезают отдельные тонкие слои (срезы). При этом каждый такой срез будет, разумеется, содержать тонкий слой самого объекта. Блок разрезается на тонкие слои с помощью ультрамикротома — прибора очень высо­ кой точности, обеспечивающего при самых благоприятных условиях получение тонких срезов толщиной до 5 нм. На фиг. 5.2 и 5.3 представлены две наиболее широко при­ меняемые модели ультрамикротомов. В качестве режущего инструмента в ультрамикротоме используется стеклянный или алмазный нож. Большое внимание уделялось пробле­ ме определения величины угла лезвия ножа, при котором поверхность среза оказывается наиболее гладкой. Оказа­ лось, что оптимальная величина этого угла составляет примерно 42°. В лабораторных условиях стеклянные ножи изготавливаются путем разлома стеклянных полос соответствующей ширины и толщины. Алмазные ножи приобретаются за плату (алмазный нож средних размеров стоит около 200 фунтов стерлингов).

Срезы в процессе резки падают в небольшую ванну с дистиллированной водой и затем всплывают на поверх­ ность. Пользуясь обычными ультрамикротомами и соблю-