Файл: Хокс П. Электронная оптика и электронная микроскопия.pdf

дая необходимые меры предосторожности, оператор соот­ ветствующей квалификации может получить достаточное количество срезов, пригодных для исследования.

Помимо обычных ультрамикротомов, в настоящее время имеются в продаже усовершенствованные приборы раз-

Ф и г. 5.3. Ультрамикротом LKB III.

Термическая подача для автоматического резания обеспечивает получение

срезов, толщина которых может меняться непрерывно в пределах 50—1300 А. Ручной механизм перемещения обеспечивает микроподачу в 1 мкм (при одном обороте рукоятки) и макроподачу в 0,5 мм (при одном обороте рукоятки) и 1 мкм (при повороте храповика на угол, соответствующий одному его зубу). 1 — станина; 2 — блок держателя ножа; з — стеклянный нож; 4 — держатель

ножа; 5 — блок держателя препарируемого объекта; 6 — плоские пружины; 7 — механизм перемещения с электромагнитом; 8 — блок объекта; 9 — дер­

жатель объекта; 10 — регулируемый поворотный сектор; 11 — головка для ориентации объекта; 12 — стальная опорная плита; 13 — демпферные подушки; 14 — рукоятка механизма макроподачи; 15 — рукоятка механизма микро­ подачи; 16 — ванна для срезов; 17 — нагревательная спираль; 18 — венти­ лятор; 19 — втягивающий магнит; 20 — рычаг для микробалансировки.

личных типов, снабженные специальными автоматиче­ скими устройствами и приспособлениями, позволяющими получать серии высококачественных срезов в больших количествах при достаточно высоком проценте выхода

6.2.2.ОБЩ ИЕ МЕТОДИКИ ПРЕПАРИРОВАНИЯ

Вразд. 5.2.1 было показано, каким образом определен­ ная часть, например, живой ткани может быть подготов­

лена для электронномикроскопических исследований, в процессе которых возможно непосредственное наблюде­ ние относительного расположения деталей и особенностей различных структур. Вместе с тем наряду с получением общей картины часто оказывается интересным и важным изучение каждого из компонентов объекта в отдельности.

Однако очень часто указанные компоненты имеют слиш­ ком малые размеры, и их непосредственное наблюдение в электронном микроскопе невозможно. В этих случаях выполнение ряда операций, описанных в предыдущем разделе, становится излишним. Некоторые живые орга­ низмы, например вирусы, по своей природе слишком малы для прямого наблюдения в приборе, поэтому методика их препарирования отличается от методики препарирова­ ния тканей для получения тонких срезов с помощью уль­ трамикротома.

По своей сути эта методика очень проста, но на прак­ тике приходится принимать ряд мер предосторожности, чтобы объект, помещаемый в электронный микроскоп, сохранил близкое сходство с организмом в его естествен­ ном состоянии. Согласно самой простой методике, иссле­ дуемый материал суспендируют в подходящей жидкости и каплю полученной суспензии наносят на сетку-держа­ тель объекта. Затем испаряют жидкость и объект окра­ шивают, после чего он оказывается пригодным для иссле­ дования. Однако при приготовлении объекта по такой методике часто происходят существенные повреждения объекта, в связи с чем была разработана методика «рас­ пыления», которая вообще приводит к гораздо лучшим результатам.

Методика распыления состоит в следующем. Исследуе­ мый материал распыляют по поверхности дистиллирован­ ной воды, налитой в неглубокую стеклянную ванну (так называемую ванну Лэнгмюра), улавливают на сеткудержатель объекта и высушивают. Для обеспечения проч­ ной подложки сетки-держатели объектов предварительно

покрывают тонкой угольной пленкой. В общепринятом способе высушивания используется тот факт, что при критической температуре граница между жидкостью и паровой фазой является наименьшей, благодаря чему возможность повреждения объекта сводится до мини­ мума.

При исследовании описываемых объектов широко применяются два метода окрашивания, с которыми мы еще не встречались: метод оттенения и метод негативного окрашивания, основанные на использовании неровностей поверхности объекта. При оттенении тонкий слой какоголибо плотного для электро­ нов вещества напыляется под острым углом на поверх­ ность объекта, выступающие детали которой обусловлива­ ют образование теней (фиг.

5.4). Этот методусиления кон­ траста электронномикроско­ пического изображения при­ меним для исследования са­

мых различных типов объектов. Негативный контраст дости­ гается при нанесении на поверхность объекта слоя кра­ сителя, который оседает в промежутках между деталями объекта, представляющими определенный интерес. При электронномикроскопических исследованиях электроны проходят через эти детали объекта беспрепятственно, вследствие чего соответствующие им зоны на изображе­ нии оказываются ярко освещенными. Зоны, соответствую­ щие промежуткам с осевшим слоем красителя, на изобра­ жении выглядят темными. Таким образом, в этом случае контраст изображения является обратным по отношению к контрасту изображений, с которыми мы встречались до сих пор и на которых картина выглядит темной на свет­ лом фоне. Именно поэтому рассматриваемый здесь кон­ траст изображения назван негативным. Для достижения негативного контраста применяются такие красители, как фосфоровольфрамат натрия или калия и ацетат или нитрат уранила.

Особенно целесообразно проводить негативное окра­ шивание при исследовании частиц, но разрешение при этом оказывается хуже, чем при химическом окрашива­ нии тонких срезов. Минимальное разрешаемое расстоя­ ние, которое может быть достигнуто методом негативного окрашивания, составляет около 20 А.

б.З. ПОДБОР МИКРОФОТОГРАФИЙ

Взаключение рассмотрим несколько электронных микрофотографий *), которые позволяют сделать опреде­

ленные, правда не окончательные и не безапелляционные, выводы, касающиеся качества и возможностей примене­ ния электронных микроскопов различных типов, рас­ смотренных в настоящей книге. Снимки I—X получены с помощью просвечивающих электронных микроскопов; изображения, представленные на снимках X I—XIV, получены на обычном растровом электронном микроскопе, и, наконец, снимок XV иллюстрирует изображение, полу­ ченное на просвечивающем растровом электронном микро­ скопе.

Возникает вопрос, насколько достоверны приведенные снимки. Мы детально описали принципы формирования изображения в электронных микроскопах различных типов, но естественно спросить, имеется ли какое-либо прямое доказательство того, что изображение, наблюдае­ мое на светящемся экране, действительно представляет собой истинную картину объекта. В случае объектов периодической структуры таким доказательством могут служить данные рентгеноструктурного анализа. Правда, с помощью электронного микроскопа может быть полу­ чена значительно более полная информация, так как микроскоп позволяет непосредственно наблюдать несовер­ шенства кристаллической структуры (например, дисло­ кации).

J) Электронные микрофотографии были напечатаны на фотобу­ маге и при их воспроизведении на обычной бумаге качество, несо­ мненно, ухудшилось. Если читатель имеет возможность получить журнал «Journal de Microscopie», специализирующийся на печата­ нии электронных микрофотографий, то он сможет составить более точное мнение о качестве оригинальных снимков.

Достоверность результатов наблюдения биологических материалов подтверждалась более последовательно и посте­ пенно. Подобные сверхструктуры наблюдались у одних и тех же органов различных организмов в разных усло­ виях. При этом обнаруживались структуры, которые можно было идентифицировать со структурами, описан­ ными исследователями в области биохимии и молекуляр­ ной биологии.

Существуют различные источники и причины заблуж­ дений и ошибочных заключений. Артефакты могут быть обусловлены неудачной настройкой электроннооптиче­ ской системы прибора, а также химическим воздействием на объект при его препарировании (например, случай­ ным образованием агломератов в процессе окрашивания). Тем не менее нет сомнения в том, что подавляющее боль­ шинство изображений, наблюдаемых в электронном микро­ скопе при разрешениях, не очень близких к предельным, отображают истинные особенности исследуемого объекта.

ЛИТЕРАТУРА, РЕКОМЕНДУЕМАЯ ДЛЯ ДАЛЬНЕЙШЕГО ЧТЕНИЯ

и др. [49], Раймера [74], Сьёстренда [81], Хаята [47], Маньяна [61] и Мика [66]. Попыткой отражения быстрого процесса развития и изменения методик препарирования является книга с вкладными листами, издаваемая Шиммелем и Фогелем [78], в которой по мере необходимости устаревшие материалы можно заменять более современ­ ными. Глауэртом [38] издается аналогичная серия лабора­ торных руководств по методикам электронномикроскопи­ ческого препарирования, которые могут быть приобретены отдельными выпусками. Гримстон [39] в очень сжатой форме на языке, доступном для физиков, излагает вопро­ сы, касающиеся электронномикроскопических исследова­ ний в области биологии. В статье Керра [12] содержатся

ЛИТЕРАТУРА

4.В i s h о p II. E ., Electron Scattering and X-ray Production, Thesis, Cambridge, 1966.

415—424 (1964).

7.В о к A. В., A Mirror Electron Microscope, Proofschrift, Delft, 1968.

8. В о к A. В ., L e P o o l e J. B., R o o s J., d e L a n g H.,

and Microanalysis, Tubingen, 1968, Springer, Berlin, 1969, S.

245—247.

31.F о r m a n e k II., M ii 11 e г M., II a h n M. H., К о 11 or T., Visualisation of single heavy atoms with the electron microscope,

36.G l a s e r W ., Grundlagen der Elektronenoptik, Springer, Vien­ na, 1952.

37. G l a s e r W ., Elektronenund Ionenoptik, H a n d b u c h d e r P h y s i k ,

33, 123—395 (1956).

38.G 1 a u e r t A. M., Ed., Practical Methods in Electron Microscopy (1972—), North-Holland, Amsterdam and London.

39.G r i m s t o n e A. V,, The Electron Microscope in Biology,