Файл: Иваницкий Г.Р. Исследование микроструктуры объектов методами когерентной оптики.pdf

мерными трудностями, имеется возможность определить двумерную частотную характеристику системы по степе­ ни деформации выходного волнового фронта [Л. 50].

Поскольку функция, описывающая распределение ин­ тенсивности света на объекте, может меняться произ­ вольно от точки к точке, ее точное аналитическое описа­ ние иногда затруднено. В этом случае образование изо­ бражений можно описывать, пользуясь методами теории случайных процессов.

Достаточно полно процесс образования изображений будут характеризовать двумерная корреляционная функ­ ция К(х', у') и двумерный энергетический спектр G(co.v, он,). Корреляционная функция для двумерного случая определяется выражением [Л. 50]

+ СО

К (х ', у') = lim - М Г / (х, у) J(х — х ', у — у') dx dy. (13)

Л'-»00 ХУ J J f/->0O —00

Энергетический спектр, согласно теореме Винера — Хинчина, представляет преобразование Фурье от функ­ ции корреляции

При образовании изображения в микроскопе за счет явлений дифракции происходит естественное разделение волн, дифрагированных на различных пространственных структурах. Угол, под которым свет дифрагирует на объекте, пропорционален отношению Х/р, где X— длина волны используемого излучения, а р — период простран­ ственной структуры.

При освещении препарата параллельным монохроматичным пучком света (когерентное освещение) про­ исходит разделение падающей волны на ряд волн, откло­ ненных под различными углами. Дифрагированные пре­ паратом пучки света концентрируются объективом в его

U \ЛТ А П I-

ничивающая попадание в микроскоп лучей, дифрагиро­ ванных под углами, большими определенной величины, по существу и определяет характер двумерной частот­ ной характеристики Н(юх. шу) микроскопической си­ стемы при когерентном освещении.

Каждая точка задней фокальной плоскости объекти­ ва связана с определенным направлением дифрагиро­ ванной волны, а интенсивность световой энергии в этой точке отражает удельный вес соответствующей прост­ ранственной частоты в формировании изображения. Про­ странственные частоты со* и (о„, имеющие размерность радиан па единицу длины, связаны с переменными £, и ц плоскости спектра, имеющими размерность единиц дли­ ны, соотношением

света.

Таким образом, при освещении объекта, находящего­ ся в передней фокальной плоскости объектива, парал­ лельным пучком света оптическая система осуществляет в задней фокальной плоскости операцию, описываемую двумерным преобразованием Фурье [формула (7)]. Эта плоскость, названная Аббе плоскостью «первичного изо­ бражения» ■[Л. 52], является плоскостью двумерного спектра изображения объекта.

Элементарные световые волны, вышедшие из каждой точки этой плоскости, интерферируют между собой во всем пространстве, находящемся за объективом, и обра­ зуют в плоскости, сопряженной с плоскостью объекта, изображение его, названное Аббе «вторичным изобра­ жением». Таким образом, между «первичным» и «вто­ ричным» изображением объекта существует зависимость, описываемая обратным преобразованием Фурье (12).

г) Краткая характеристика рассматриваемых в книге методов

Использование когерентного излучения при анализе микроструктур позволяет производить как интегральную оценку геометрических параметров совокупностей функ­ циональных элементов, так и индивидуальное исследо­ вание каждого из них.

18

Возможность сравнительно простого получения ди­ фракционных спектров от целых ансамблей микроскопи­ ческих объектов и дальнейшей интерпретации этих спек­ тров с целью определения параметров объектов делает использование когерентных оптических систем чрезвы­ чайно привлекательным в микроскопическом анализе (гл. 2). Эти методы весьма эффективны в световой ми­ кроскопии, особенно для исследования изменения пара­ метров совокупности микрообъектов. Их также можно использовать для анализа электронномикроскопических изображений. Ограничивающим условием в этом случае является требование к достаточной однородности функ­ циональных элементов в исследуемом ансамбле.

При автоматической идентификации отдельных ми­ крообъектов в тех случаях, когда отсутствуют достовер­ ные различия в характеристиках объекта и фона, целе­ сообразно использовать статистические методы обнару­ жения. При определенных допущениях о статистической структуре фона и объекта эту задачу могут выполнять устройства двумерной согласованной фильтрации (гл. 3, 4). В этом случае анализу подлежат поля зрения срав­ нительно небольших размеров и обнаружение ведется «поэлементно», т. е. в расчет принимается каждый из мнкрообъектов.

Согласованная фильтрация представляет собой один из методов оптимальной обработки информации в смыс­ ле максимизации отношения сигнал/шум. Поэтому ана­ лизируемые изображения могут быть достаточно «за­ шумлены», т. е. представляющие интерес функциональ­ ные элементы могут маскироваться мешающим фоном или другими элементами.

Обсуждаемые в литературе методы применения дву­ мерной согласованной фильтрации для анализа изобра­ жений связаны, как правило, с обнаружением сигналов детерминированной формы (буквы, отпечатки пальцев). Специфические особенности приложения этих методов к анализу изображений микрообъектов, в частности био­ логических, почти не рассматривались.

Основной особенностью применения указанных мето­ дов для обнаружения бномикрообъектов является широ­ кая изменчивость их признаков. Случайные положения и ориентация объекта в поле зрения микроскопа, а так­ же случайный характер изменения его формы фактиче­ ски сводят любую из задач автоматического анализа

к задаче обнаружения объекта с неполностью известны­ ми параметрами.

Интересные возможности исследования изменяющих­ ся во времени объемных микроструктур, недоступные традиционной микроскопии, демонстрируют новые коге­ рентно-оптические методы, связанные с голографической микроскопией (гл. 5).

Рассмотрение упомянутых вопросов и составляет основное содержание этой книги.

Г л а в а в т о р а я

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ МИКРООБЪЕКТОВ С ПОМОЩЬЮ РЕГИСТРАЦИИ ИХ СВЕТОРАССЕЯНИЯ

5. ФОРМУЛИРОВКА ЗАДАЧ

В настоящее время в практике микроскопических исследований используется свыше 50 методов анализа количества и геометрических параметров микрообъектов, находящихся в срезах, мазках или во взвешенном со­ стоянии в жидкости н газе. Больше половины этих ме­ тодов оптические. Среди них особое место занимают ме­ тоды светорассеяния.

Методы светорассеяния весьма перспективны. Основ­ ное их преимущество в применении к исследованию био­ логических объектов состоит в том, что на объекты ока­ зывается слабое световое воздействие, т. е. они слабо повреждаются. Это позволяет следить за кинетикой про­ цессов, в то время как большинство микроскопических методов являются статическими и оперируют, как пра­ вило, с мертвым, фиксированным препаратом.

Для изучения объектов неживой природы указанное достоинство не является решающим. Однако возмож­ ность получения количественного параметра, характери­ зующего сразу всю совокупность функциональных эле­ ментов, бывает также весьма привлекательной.

Исследование параметров микрообъектов с помощью изучения их светорассеяния относится к так называемым обратным задачам. Основной их особенностью является решение задачи в обратном направлении причинноследственных отношений, т. е. по изучению следствия (характера светорассеяния) восстанавливается причина (микроструктура объектов).

20

Можно утверждать, что если удалось измерить ин­ тенсивность, поляризацию и фазу световых волн, рассе­ янных мпкрообъектами по отношению к падающему свету, как функцию углов рассеяния, то согласно фор­ мальной постановке обратной задачи рассеяния [Л. 134] этой информации в принципе достаточно для получения количественного описания геометрических параметров микроструктуры объекта. Как показал французский ма­ тематик Адамар, вычислительная схема подобных задач очень чувствительна к небольшим ошибкам регистрируе­ мых данных. При обратном пересчете они приводят

кбольшим ошибкам в определяемых параметрах. Сужение общности постановки задачи, использова­

ние дополнительной информации о микроструктуре по­ зволяет регулярнзировать обратную задачу— избавить­ ся от неоднозначности в ее решении.

В настоящее время разработаны приближенные ме­ тоды расчета обратной задачи рассеяния как для микро­ объектов, размер которых меньше длины световой волны (метод Дебая [Л. 9, 73]), так и для микрообъектов раз­ мером больше длины световой волны [Л. 54, 96, 114]. Во втором случае рассеяние рассматривается как комбина­ ция дифракции, преломления и отражения.

По мере увеличения размера микрообъектов в обла­ сти малых углов основной вклад в рассеяние света начи­ нает вносить дифракция Фраунгофера [Л. 76, 100].

В дальнейшем будут рассматриваться именно этот случай светорассеяния и его практические приложения.

Введем дополнительно следующие ограничения:

1)свет, рассеянный одним функциональным элемен­ том, достигает приемника излучения, не рассеиваясь на других элементах (однократное рассеяние);

2)функциональные элементы не изменяют длины

волны облучающего их света (люминесценция объекта отсутствует);

3) микроструктура либо полностью упорядоченная (решетка), либо полностью хаотическая (случайно рас­ положенные микрообъекты). Во втором случае расстоя­ ние между элементами распределено по случайному закону с нулевой корреляцией (практически это дости­ гается, когда расстояние между микрообъектами в 4 — 5 раз больше их среднего размера [Л. 9]). Последнее дает возможность пренебречь межэлементной деструк­ тивной интерференцией, что в свою очередь позволяет

21