Файл: Шамин А.Н. Развитие химии аминокислот.pdf

влекла внимание Л. Пастера, не пропускавшего нп одного исследования веществ, обладающих оптической актив­ ностью. Таким образом, был поставлен вопрос о стерео­ химии аминокислот.

Пастер заметил, что яблочная и аспарагиновая кисло­ ты обладают способностью вращать плоскость поляриза­ ции, а фумаровая кислота этой способности лишепа [12]. Пастер считал, что если синтез Дессеня трактуется пра­ вильно, то невозможно объяснить образование оптически активной аспарагиновой кислоты из фумаровой. Но синте­ тическая аспарагиновая кислота у Дессеня была неактив­ ной.

Пастер приступил к изучению химических н оптических свойств активной и неактивной аспарагиновой и яблочной кислот. Он сравнил яблочную кислоту, полученную из ас­ парагиновой кислоты, с естественным продуктом [13]; при этом он показал, что диамид яблочной кислоты, также как и амид яблочной кислоты (оба получены амминироваиием эфира яблочной кислоты аммиаком), был изомерен, но не идентичен аспарагину. Оксаминовая кислота и оксамид при воздействии щелочи при нагревании выделяли азот, в то время как аспарагин при такой же обработке вы­ делял в виде аммиака только половину своего азота. Аспа­ рагиновая кислота и вовсе не выделяла его. Такпм обра­ зом, вопрос о строении аспарагиновой кислоты и аспараги­ на вновь оказался далеким от решения.

Эти работы имели важное значение: они не только дали новые данные для заключений о строении аспарагиновой кислоты и аспарагина, но впервые затронули вопросы стереохимии аминокислот.

Данные о свойствах и превращениях тирозина, распро­ страненность которого в белковых веществах была дока­ зана многочисленными работами [14—18], позволили от­ нести его также к ряду глицин — лейцина. К. Викке уже в 1857 г. распознал принадлежность тирозина к тем же веществам, что и глицин, лейцин н т. п. Он отмечал: «Одно­ временное выделение тирозина и лейцина при разложении белковых веществ, в некотором отношении сходные их формулы и легкая растворимость обоих в кислотах и щело­ чах дают возможность предположить, что тирозин обладает строением, сходным с лейцином, и может стоять в ряду ароматических кислот, как лейцин в ряду жирных кис­ лот» [18].

37

В последовании свойств тирозина наиболее сильно сказался новый для физиологической химии методологи­ ческий подход — сопоставление некоторых конечных про­ дуктов обмена веществ и предполагаемых продуктов рас­ пада сложных органических соединений или промежу­ точных продуктов обмена, к которым начали относить

иаминокислоты.

Кконцу 70-х годов XIX в. начали использовать метод введения в организм чужеродных соединений с характер­

ными свойствами с целью проследить их превращения. К этим работам относятся опыты Э. Баумана и К. Прёйсе, вводивших собакам бромбеизол и обнаружившим в 1881 г. его превращение в бромфеиилмеркаптановую кислоту [1 9 -2 1 ]. О значении этих работ для изучения структуры цистпиа речь пойдет ниже. Важно, что сходным путем были получены принципиальные сведения о связанных с тирозином продуктах обмена веществ.

Прп изучении свойств тирозина и его распространен­ ности в организме (это также один из новых аспектов изучения аминокислот) были проведены первые патологохпмпческпе исследования. Ф. Фрерпхс и Г. Штеделер в 1883 г. обнаружили образование тирозина в больной пече­ ни [22], а затем в моче и крови [23]. Через несколько лет Й. Нёйкомм обнаружил лейцин п тирозин в органах людей, умерших от различных заболеваний [24]. И, наконец, в 1861 г. К. Бедекер сделал важное открытие: он заметил зависимость появлеипя 2 ,5-диокспфенилуксусной (гомогентизпиовой) кислоты в моче при алкаптонукрпи от вве­ дения в организм тирозина [25]. В дальнейшем изучение этого явления пос.лужило одним из исходных пунктов создания учения об азотистом обмене в организме.

Эти исследования повлияли на решение вопроса о строе­ нии тирозина и его отнесении к ряду аминокислот. В 1859 г. Г. Штеделер на основании этих исследований подтвердил точку зрения, что тирозин является амино­ кислотой и относится к ряду лейцина [26]. Однако строе­ ние тирозина окончательно ие было выяснено и остава­ лось неясным вплоть до его синтеза.

В 1865 г. Р. Шмидт и О. Нассе предположили, что тиро­

пристально изучавшим свойства тирозина [29, 30].

В 1879 г. Э. Позен прямым аминированием бромгидро-

38

коричной кислоты синтезировал фенилаМниопрониоповую кислоту — среиилаланин [31]. Полученные им характе­ ристики синтезированного вещества свидетельствовали, что ему удалось получить именно фенилаланин, но он ошибся в определении точки плавления (120—121° С вме­ сто истинной точки плавления 284° G с разложением). Поэтому синтез Позена подвергался сомнениям, и перво­ открывателями фенилаланина считают Э. Шульце и И. Барбпери, выделивших его из белковых гидролизатов.

Аминокислоты как постоянные компоненты белковых молекул

Одновременно с изучением общих свойств уже известных аминокислот продолжались исследования строения белков, которые позволили получить данные о наличии амино­ кислот в белковых гидролизатах. Начиная с 1865 г., когда в гидролизате белков шелка Э. Крамером был открыт се­ рин, и до конца XIX в., когда в гидролизатах белков был обнаружен цистин — первая из открытых аминокислот, список белков, в гидролизатах которых обнаруживали аминокислоты, непрерывно рос. Одновременно открывали уже известные и неизвестные ранее аминокислоты в бел­ ковых гидролизатах. К 1899 г. список известных амино­ кислот увеличился до тринадцати (не считая открытого в 1896 г. Э. Дрекселем 3, 5-диподтпрозина, или иодогоргоевой кислоты), при этом непосредственно в белках были открыты три новых аминокислоты: серин, глутаминовая кислота и лизин. Стало известно, что в состав белковых веществ входят (или образуются при их распаде) двена­ дцать аминокислот (неясно было только происхождение валина).

Новые открытия усложнили понимание положения аминокислот среди других групп органических соединений. Новые вещества обладали далеко не сходными свойствами, и их сопоставление было делом нередко весьма затрудни­ тельным.

В 1865 г. Э. Крамер в Гамбурге изучал свойства необ­ работанного шелка и обнаружил, что шелк, состоящий из фиброина, сверху покрыт тонким слоем белкового веще­ ства. Крамер назвал его серицином. Гидролизат серицпна содержал тирозин и вещество, сначала принятое Крамером за глицин. Но изучение образования медных солей очи-

39

щениого перекристаллизацией вещества показало, что это вещество новое, отличиое от глицина. Крамер дал ему на­ звание «серин» [32]

Работу Крамера можно признать классической для данной фазы исследований аминокислот. Из полученного нм препарата он стремился выжать максимум возможных результатов, на основе полученных данных он сделал много важных и совершенно правильных выводов. Проведя образцовый по точности анализ, он дал сразу же правиль­

на один эквивалент больше кислорода, чем аланин, и имеет с последним много общего в химических свойствах. Так как уже было известно, что аланин близок молочной кис­ лоте, то Крамер предположил, что серин должен являться аналогом глицериновой кислоты и, действительно, превра­ тил в нее серин действием азотистой кислоты. Он сделал даже заключение о возможности перевода серина в аланин восстановлением, но этой реакции не осуществил. Мало того, Крамер отметил сходство серина с цистином, который еще не был обнаружен в белковых гидролизатах.

Работа Крамера выделялась по своей завершенности среди работ этого периода, но после ее опубликования серин уже не привлекал внимания химиков до работ Э. Фи­ шера, о нем не появилось больше ни одной публикации.

Таким образом, открытия новых аминокислот знамено­ вали начало интенсификации развития аминокислотной химии белка.

Уже в 1886 г. Г. Всртер, профессор минералогии Кёниг­ сбергского университета, опубликовал сообщение, что он исследовал переданное ему Г. Рпттхаузеном для кристал­ лографического анализа вещество, выделенное из пшенич­ ного белка глутина [33]. Это была одноосновная азот­ содержащая кислота, формулу которой Вертер вывел на основании анализа свободной кислоты, а также ее медной и бариевой солей, Ci0H9NO8, при С = 6 и О = 8 (C5H0NO4 в современных атомных весах). Вертер дал новому соеди­ нению название «глутаминовая кислота».

В том же году появилось сообщение самого Риттхаузена о методе выделения новой аминокислоты [34]. Гидро­ лизу был подвергнут так называемый глутенфибрии —1

1 Полный текст статьи Э. Крамера см. в Приложениях (стр. 120).

40

растворимая в спирте фракция пшеничного глутина. Уже при наблюдении за процессом гидролиза Рпттхаузен заметил образование значительно более кислых, чем обык­ новенно, продуктов распада белков. Так, карбонат, обра­ зующийся при нейтрализации серной кислоты, распадался и избыток кальция приходилось удалять щавелевой кисло­ той, что создавало дополнительные трудности при очистке гидролизата (щавелевую кислоту удаляли карбонатом свинца, избыток свинца удаляли действием ITS). В гид­ ролизате при упаривании образовывались кристаллы ти­ розина, смешанные с каким-то неизвестным веществом. Последнее осторожно растворяли в горячей воде, отделяя таким образом от кристаллов тирозина. Из раствора при выпаривании выпадали блестящие ромбовидпые кристал­ лы. Такие кристаллы и получил для анализа Вертер.

Вгидролизате глиадина пшеницы содержание глутами­ новой кислоты доходило до 30%, по данным Риттхаузена. Он исследовал образование бариевых, медных и серебря­ ных солей повой кислоты. Было показано, что при обра­ ботке азотистой кислотой глутаминовая кислота дает безазотпстое соединение, которое Рпттхаузен считал молочной кислотой. Им было показало, что глутаминовая кислота содержится во мпогих растительных белках [35].

В1873 г. Г. Глазпветц и Й. Габерман впервые исполь­ зовали для гидролиза белка соляную кислоту в присутствии хлорида олова. При этом ими было показано, что глутами­ новая кислота из гидролизата легко отделяется в виде гид­ рохлорида. Этим методом установлено, что глутаминовая кислота образуется и при гидролизе животного белка —

казеина [3 6 ]2.

В 1868 г. Рпттхаузен впервые обнаружил в белковых гидролизатах и аспарагиновую кислоту [37]. Открытие аспарагиновой кислоты в белках было связано с двумя важными историческими обстоятельствами. Во-первых, Рпттхаузен намеренно искал новые вещества среди фрак­ ций, полученных в результате многочисленных обработок

2 Г. Глазиветц п Й. Габермен впервые обратплп внимание на «из­ быточный» аммпак, образующийся при гидролизе белков, и свя­ зали его с образованием аспарагиновой и глутаминовой кислот. Опи совершенно справедливо предположили, что в белках этот аммпак принадлежит аспарагину и глутамину, входящим в со­ став белков и распадающимся при гидролизе до соответствую­ щих кислот.

41

для выделения тирозина, лейцина' й глутаминовой кисло­ ты, которые ранее просто выбрасывали. Во-вторых, для обнаружения в этпх фракциях неизвестного вещества Риттхаузеиу пришлось искать новые способы осаждения и но­ вые ос-адптелп. В результате пм был открыт способ осажде­ ния аспарагиновой кислоты спиртом из обработанного углекислым барпем раствора. Этот метод, усовершенство­ ванный и расширенный, сыграл впоследствии важную роль в развптпп аналитической химии аминокислот под назва­ нием метода Форемана.

Едппствеппо, в чем ошибся Рпттхаузен, так это в ана­ лизе барпевоп соли выделенной аминокислоты. Он посчи­ тал, что она пмеет состав C8HuN2Oo. Поэтому сначала Риттхаузеп принял ее за новую аминокислоту и дал ей назва­ ние легумпповой, правда с оговоркой, что дальнейшие ис­ следования должны подтвердить правильность его заклю­ чения.

В *1868 г. Рпттхаузен опублпковал результаты дальней­ шего исследования нового вещества [37]. Цикл его ис­ следований аспарагиновой и глутампной кпслот является очепь показательным с точки зрения логики истолкования получаемых результатов эмпирического попска. Исходя из предположения, что перед ним повое вещество, Рпттхаузен объяснил трудпостп его очистки и переосаждеипя тем, что оно сильно загрязнено кристаллическими веществами ино­ го строения п некристаллическими соедииеппямп.

Однако дальнейшая работа по очистке этой смеси пока­ зала, что опа может быть успешно раскристаллизована. При этом, к удивлению Рпттхаузепа, образовывались крис­ таллы уже пзвестпых глутампповой и аспарагиновой кпс­ лот. Поэтому усилия ученого были направлены па поиски методов осаждения п очистки малых количеств аспараги­ новой кислоты и было получено окончательное доказатель­ ство ее присутствия в белковых гидролизатах.

Последующие анализы глутаминовой и аспарагиновой кислот привели Рпттхаузепа к мнению, что это гомологичпьте соединения. Он показал также, что аспарагиновая кислота образуется при гидролизе многих растительных белков. Почти одновременно аспарагиновая кислота была обнаружена В. Крейслером в казеине и яичном белке [38].

Доказательство присутствия в гидролизатах белков ала­ нина было получено не сразу. Это было сделано Т. Вейлем в 1888 г., но, вероятно, оно могло быть сделано со всей

42

достоверностью еще в 1875 г. П. Шютценберже, если бы не торопливость п небрежность, допущенные французским химиком.

П. Шютценберже и А. Буржуа подвергли шелк дейст­ вию Ва(ОН)2 в автоклаве при 150—200° С. Этот новый ме­ тод разложения белков впоследствии неоднократно исполь­ зовался в работах различных исследователей [39] и самого Шютценберже при попытках получить идентифицируемые фрагменты белковой молекулы. С ним была связана исто­ рия создания так называемой урепдной гипотезы строения белка [40]. Однако этот метод не всегда был удобен для выделения и идентификации аминокислот из-за возможно­ сти образования многочисленных вторичных продуктов. Авторы метода этого обстоятельства не учли. Поэтому ра­ боты Шютценберже пестрели описаниями аминопропзводных довольно сложного строения, присутствия которых в белковых гидролизатах ие могли подтвердить впоследствии другие ученые.

При гидролизе шелка Шютценберже и Буржуа оппсалп получение кристаллического тирозина (10%), смеси гли­ цина и аланина (60%), «аминомасляной кислоты» (10%) и «аминоакриловой кислоты» (20%). Но ни одно из этих соединений не было выделено в чистом виде и не подверг­ нуто достаточно достоверной идентификации. В 1879 г. Шютценберже опубликовал обширную статью, посвящен­ ную результатам изучения гидролиза яичного альбумина баритовой водой под давлением. На этот раз им былп вы­ делены кристаллические фракции, подвергнутые затем анализу [41]. Одна из фракций — вещество, которое обла­ дало элементным составом, на 0,2% отличающимся от состава аланина. Однако Шютценберже не сопоставил его с аланином. Работа Шютценберже невыгодно отличается от работы Э. Крамера.

Из-за небрежности оформления результатов и не­ последовательности в проведении исследования Шютцен­ берже лишился и чести первооткрывателя валина в соста­ ве белка. В работе [41] он также сообщил об открытии им в гидролизате яичного альбумина аминовалерпаиовой кислоты. Его «буталаиип» имел состав C5H 11NO2, но тож­ дественность с валином никак ие была подтверждена.

Лишь в 1888 г. Т. Вейлем были получены бесспорные доказательства присутствия аланина в белковых гидроли­ затах [42]. После осаждения тирозина в гидролизатах, нм

43

было получено при выпаривании аморфное вещество, со­ держание которого в гидролизате составляло около 15%. Вновь растворив вещество, он получил кристаллический осадок (пз разбавленного спирта с добавлением аммиака). Полученные кристаллы имели ромбовидную форму и при анализе оказалось, что они идентичны аланину. Вейль счи­ тал аланин амннопропионовой кислотой: «анализы показа­ ли наличие аланина (амннопропионовой кислоты)». Ала­ нии шелка, вероятно, является а-алаиином.

О работах Шютценберже и Буржуа Вейль либо не знал, либо но придавал им значения.

В 70—80-х годах XIX в. медленно укреплялось пред­ ставление, что знания о продуктах гидролиза белковых веществ несут в себе важную информацию о строении бел­ ковой молекулы. Начиная с середины XIX в., интенсивно изучались процессы разложения белков протеолитически­ ми ферментами. Возникли представления о пептонах и протеозах, изучение которых стало рассматриваться как наиболее верный путь к установлению строения белковой молекулы. Однако химики среди продуктов протеолиза белковых веществ, как правило, обнаруживали и амино­ кислоты.

Уже в 1870 г. русским химиком II. Н. Любавиным, ра­ ботавшим в лаборатории Ф. Гоппе-Зайлера, была высказа­ на гипотеза о преимущественно аминокислотном строении белка. Исследуя процессы гидролиза и протеолиза различ­ ных белков (казеина и альбумина), а также процессы раз­ ложения пептонов, Любавин отметил, что «белковые веще­ ства и пептоны сильно напоминают аминокислоты, и их уже известные продукты распада являются только амино­ кислотами (глнкоколлом, лейцином, тирозином, аспараги­ новой и глутаминовой кислотами)» [43, стр. 470]. Далее он показал, что гидролиз всегда, в конце концов, приводит лишь к образованию аминокислот, если не считать продук­ тов неопределенного строения, происхождение которых мо­ жет быть объяснено различными вторичными процессами или просто загрязнением препаратов.

Таким образом, уже в 1870 г. были созданы предпосыл­ ки развития химии аминокислот как важнейшей составной части химии белка. Мощный стимул получили попытки выделения новых аминокислот из белковых гидролизатов. Первые итоги этих работ мы уже видели. В составе белков были открыты серии, глутаминовая и аспарагиновая кис-

44

лоты и аланин. Э. Шульце п Й. Барбиерп открыли в соста­ ве растительных белков фенилаланин [44]. Но эти работы, особенно после разработки в 1873 г. метода гидролиза бел­ ков соляной кислотой Г. Глазиветцем и Й. Габерманом, привели к несколько необычной трактовке получаемых ре­ зультатов. Возникло представление, что в белках содер­ жится лишь ограниченное количество аминокислот, а именно: лейцин, тирозин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Все остальные аминокислоты, а также некоторые еще неидентифицпрованные примеси стали рассматривать­ ся как осколки этих веществ или как самые ближайшие производные, самообразование которых допускалось в ре­ зультате вторичных процессов. Во всяком случае «закон­ ность» их присутствия в гидролизатах вызывала сильные сомнения. Лишь в 1885 г. Э. Шульце и Барбиери пробили первую брешь в этих представлениях, доказав, что фенил­ аланин тоже является нормальным и часто встречающим­ ся продуктом распада многих белков [45, 46].

Гипотеза Любавина оказалась на два десятилетия ис­ каженной и полузабытой. Этому способствовало и то обсто­ ятельство, что опубликована его статья была в сборнике ра­ бот лаборатории Гоппе-Зайлера — издании, не получившем большого распространения и изданиом малым тиражом. Только в 1889 г., после работ Э. Дрекселя, начинаются важные изменения в подходе к проблеме состава продук­ тов гидролиза белков. Дрексель начал с уточнения деталей процесса гидролиза и скрупулезного анализа всех конечных его продуктов. Он подверг сомнению результаты Шютценберже и предложенную им уреидную гипотезу строения бел­ ка, но ограничился лишь указанием на потери вещества при обработке гидролизатов баритовой водой. Затем Дрек­ сель повторил опыты Глазиветца и Габермана, поставив себе цель исключить потери вещества при процессах гид­ ролиза и фракционирования. Гидролизуя казеин соляной кислотой в присутствии хлорида олова, Дрексель после удаления глутаминовой кислоты обрабатывал маточный раствор фосфорновольфрамовой кислотой. При этом выпа­ дал объемистый осадок, ранее теряемый химиками, кото­ рый подвергался дальнейшей очистке. В результате в ру­ ках Дрекселя оказались кристаллы, которые он попытался очистить переосаждением из спирта с примесью эфира. В результате было получено маслянистое вещество, кото­ рое частично кристаллизовалось. Полученные таким путем

45