Файл: Рачинский, В. В. Курс основ атомной техники в сельском хозяйстве учебное пособие.pdf

растворы. В условиях почвенной культуры меченый питательный элемент вводят в состав меченого удобрения (жидкого или твер­ дого) . Можно осуществить также мечение подвижных форм элементов почвы.

В опытах с животными меченые элементы можно вводить как в питательные, кормовые растворы, так и в твердые корма.; В опытах с микроорганизмами меченые элементы могут нахо; диться в составе жидких и твердых питательных сред.

Основное условие к питательным средам с мечеными эле­ ментами— меченый элемент должен находиться в определенной химической форме и равномерно распределяться в питательной среде. Должна быть известна удельная активность меченого эле­ мента в питательной среде.

П о д г о т о в к а ж и в ы х о р г а н и з м о в к о п ы т у . Био­ логические исследования необходимо проводить с соблюдением всех правил постановки биологических опытов, с учетом суще­ ствования биологической изменчивости, биологических флуктуа­ ций. Поэтому биологические эксперименты следует ставить с достаточным числом повторностей. Это значит, что в биологи­ ческий эксперимент необходимо вводить достаточное число био­ логических организмов — особей, сосудов с растениями, число животных, повторных культур — посевов в опытах с микроор­ ганизмами. Подготовленные к опыту живые организмы, биоло­ гические объекты должны быть предельно стандартизованы — однородны, однотипны, выровнены по биологическому состоянию.

В зависимости от времени, когда вводят меченый элемент в живой организм, можно указать два варианта постановки опытов: 1) живой организм (или организмы) выращивают на среде с меченым элементом от начала роста и развития (онто­ генеза). Например, растение выращивают от семени или куль­ туры микроорганизмов выращивают от минимального посева; 2) меченый элемент вводят в живой организм на определенной

случае в живом организме при выращивании практически на­ капливается только меченый элемент (тотальное мечение). Количеством немеченого элемента в семени или посеве (для микроорганизмов) можно пренебречь.

Во втором случае живые организмы выращивают на среде с немеченым элементом, а затем в определенные моменты онто­ генеза меченый элемент вводят в живой организм. Таким обра­ зом, в живом организме будет находиться немеченый и меченый элементы.

введения меченых элементов в растения: 1) растения помещают

265

на питательные среды с мечеными элементами (естественный путь введения), 2) в различные органы растений (инъекцируют растворы с меченым элементом; 3) растворы с мечеными эле­ ментами наносят на листья растений (при исследовании вне­ корневых подкормок). Для инъекции используют медицинские шприцы или стеклянные капилляры. Инъекцию растворов обычно производят в проводящие системы растений. В опытах с живот­ ными: 1) меченые элементы вводят с пищей или питьевой водой; 2) инъецируют в кровеносную систему, под кожу и т. п.; 3) растворы с мечеными элементами наносят на поверхностные ткани, кожу. В микроорганизмы меченые элементы вводят через питательные субстраты.

ние) биологических объектов — очень важная операция, которая должна обеспечить по возможности мгновенную остановку мета­ болизма и не допускать каких-либо постфиксационных перерас­ пределений меченого элемента. К сожалению, эти идеальные требования не всегда выполняются, что приводит к искажению реальной картины распределения меченого элемента, к различ­ ным артефактам. На это обстоятельство иногда не обращают внимания, хотя оно имеет важное значение для успеха биоло­ гических исследований. Наиболее совершенным способом фикса­ ции живых организмов, по-видимому, является фиксация жид­ ким азотом. Она обеспечивает почти мгновенное умерщвление организма и практически исключает перераспределение элемен­ тов и их соединений (диффузия в твердых телах протекает очень медленно).

В опытах с растениями кроме фиксации жидким азотом при­ меняют тепловую фиксацию — помещение растений в термостат при 105° С, погружение растительного материала в кипящий спирт и некоторые другие среды. Все эти способы весьма несо­ вершенны. Но их часто применяют из-за отсутствия жидкого азота. Возможное перераспределение меченых элементов в про­ цессе фиксации может исказить реальную картину распределе­ ния при подготовке растений к авторадиографии. Чтобы этого не происходило, растение перед фиксацией сразу расчленяют (корни, стебли, листья разных ярусов, плоды). Затем фикси­ руют каким-либо доступным способом.

В опытах с животными после умерщвления животного также сразу производят его анатомирование и расчленение, а затем фиксируют отдельные органы.

При изучении метаболизма микроорганизмов необходимо производить фиксацию культуры, как правило, жидким азотом.

А в т о р а д и о г р а ф и я . В биологических исследованиях для изучения пространственного распределения меченых эле­ ментов в биологических объектах широко пользуются методами макро- и микроавторадиографии.

266

Не всякое образовавшееся на фотоэмульсии почернение после экспонирования на ней радиоактивных тканей отображает лока­ лизацию меченого вещества. Почернение может возникнуть вследствие употребления загрязненных радиоактивностью ин­ струментов, посуды, кассет и другого оборудования.

Темные пятна и другие дефекты могут появиться на фото­ эмульсии вследствие ошибок или допущенной небрежности в процессе проявления экспонированной фотопленки. Это легко устранимые недостатки. К более серьезным недостаткам можно отнести химическое действие самой ткани на фотоэмульсию. На­ пример, после 15—20-дневного экспонирования при комнатной температуре сырых, нерадиоактивных срезов почки, печени и других органов животных на фотопленке любого типа полу­ чают хорошо детализированные отпечатки этих объектов. За такое же время экспозиции аналогичным образом получают отпечатки образцов древесины хвойных деревьев. В случае дре­ весины фотографически активным веществом являются смоли­ стые вещества, выделяющие сильнодействующие летучие перекисные соединения. Отпечатки, получаемые от нерадиоактивных биологических тканей, называют автохемографами. Из сказан­ ного следует, что при авторадиографическом методе исследова­ ния тканей необходимо критически оценивать появляющиеся на фотоэмульсии почернения, обращая особое внимание на методы подготовки тканей, условия экспонирования их на фотоэмульсии и обработку экспонированных фотоматериалов.

При использовании сырых или подсушенных нефиксирован­

тканью и фотоэмульсией водонепроницаемых прокладок. Целло­ фановые или целлулоидные пленки непригодны для этой цели, так как при длительных экспозициях (15—20 дней) они про­ пускают влагу. Хорошие результаты обеспечивают прокладки из алюминиевой или станиолевой фольги толщиной 0,01—■ 0,02 мм. Но наличие прокладок приводит к поглощению низко­ энергетических р-частиц, что исключает возможность использо­ вания в качестве радиоактивных индикаторов таких радиоактив­ ных изотопов, как 14С, 4SCa и 35S. Для 32Р, 1311 или других изо­ топов с жестким p-излучением разрешающая способность авто­ радиографического изображения тем выше, чем тоньше тканевый срез и чем меньше промежуток между срезом и фотоэмульсией.

В случае сырых тканей невозможно изготовить очень тонкие срезы и обойтись без водонепроницаемых прокладок между срезом и фотоэмульсией. Поэтому авторадиографические изобра­ жения образцов сырых тканей обладают очень низким разре­ шением деталей.

Абсолютно сухая ткань при экспонировании на фотопленке в отсутствие влаги, например, в эксикаторе или в другом гер­ метически закрывающемся сосуде, содержащем влагопоглощаю­

267

щий агент, не оказывает заметного химического действия на фотоэмульсию. Высушивание образцов ткани производят в су­ шильном шкафу при температуре Около 100° С до абсолютно сухого состояния. Метод можно использовать для получения авторадиографов листьев растений, срезов корнеплодов, неко­ торых овощных и фруктовых культур и других объектов.

'С помощью которых получают авторадиографы с достаточно высоким разрешением деталей.

Недостатком метода высушивания являются сморщивание, усадка и деформирование тканей, содержащих большие коли­ чества воды. Кроме того, возникают различные артефакты вследствие посмертной диффузии веществ, протекающей в пе­ риод между прекращением жизнедеятельности клеток и окон­ чательным обезвоживанием ткани. Такие артефакты обнаружи­ ваются в мелких деталях, например в волосках, покрывающих листья некоторых растений.

Фиксирование тканей замораживанием и экспонирование за- 'мороженных образцов на фотоэмульсии при низкой температуре обладают рядом преимуществ по сравнению с другими спосо­ бами подготовки тканей для исследования авторадиографиче­ ским методом.

Скорость охлаждения небольших биологических объектов (семян, листьев) при погружении их в жидкий азот (— 193° С) 'или в сухой лед (—72° С) такова, что отмирание клеток и фикси­ рование в них веществ при низкой температуре протекают прак­ тически одновременно. Этим предупреждается возникновение артефактов, связанных с посмертной внутриклеточной диффу­ зией веществ.

Замороженная ткань обладает достаточной твердостью, чтобы готовить из нее срезы толщиной 1,5—2 мм с помощью меха­ нических циркулярных пил или ножевок.

Точную плоскую поверхность можно получить заморажива­ нием образцов ткани в специальных тканедержателях и обра­ боткой их на токарных и фрезерных станках. Экспонирование замороженных препаратов на фотоэмульсии при низкой тем­ пературе (от —20 до —30° С) сохраняет зафиксированное ранее состояние веществ и полностью устраняет химическое действие ткани на фотоэмульсию.

Препараты, изготовленные из замороженной ткани, сохра­ няют цвет и прижизненное расположение твердых, жидких и полужидких масс, что значительно облегчает расшифровку локализации меченого вещества по его авторадиографу.

При использовании радиоизотопов с большим периодом полу­ распада (14С, 35S, 45Са и др.) последовательным стачиванием замороженного объекта и экспонированием на фотоэмульсии

268