Файл: Рачинский, В. В. Курс основ атомной техники в сельском хозяйстве учебное пособие.pdf

каждой вновь ооразованной поверхности можно получить серию авторадиографов, отображающих пространственное распределе­ ние радиоизотопа в изучаемом объекте.

С помощью обычной контактной авторадиографии выявить внутриклеточную локализацию радиоизотопа невозможно. Этому мешают крупное зернение оптических и рентгеновских эмульсий, толщина светочувствительного слоя и наличие воздушного про­ странства между препаратом и слоем фотоэмульсии.

Для этой цели используют мелкозернистые, так называемые ядерные эмульсии. К фабричной ядер.ной эмульсии добавляют дистиллированную воду в отношении 1 : 1 и расплавляют в во­ дяной бане при 40'—42° С.

Предметные стекла с наклеенными на них гистологическими препаратами подогревают до такой же температуры. Затем на каждый из препаратов пипеткой наносят две-три капли рас­ плавленной эмульсии и разравнивают стеклянной палочкой. Лучшие результаты получают в том случае, если предметные стекла погружают вертикально в расплавленную эмульсию.

Высушенные в темноте стекла переносят для экспонирования в эксикатор. После экспонирования препараты подвергают фотографической обработке, окрашиванию и высушиванию. Су­ хие препараты помещают в канадский бальзам. Препарат и образованный под ним авторадиограф неотделимы друг от друга, и их изучают под микроскопом одновременно. При боль­ шом увеличении (200 и выше) микроавторадиограф представ­ ляется в виде отдельных групп восстановленных серебряных зе­ рен, расположенных под внутриклеточными структурами, где локализовано меченое вещество. Разрешающая способность та­ кого метода достигает 2,5 мкм.

Обычные авторадиографы растений показывают лишь лока­ лизацию меченных радиоактивными изотопами элементов в раз­ ных органах и не выявляют того, в каких конкретных формах соединений (в белках, нуклеиновых кислотах, липидах и т. д.) и в каких фракциях клетки (в вакуолярном соке, плазме, орга­ ноидах и т. д.) находятся меченые элементы. Это обстоятельство ограничивает применение обычной авторадиографии в физиоло­ гии и биохимии растений и не позволяет применять ее для анализа превращений веществ в растениях для изучения лока­ лизации и синтеза, например, белков и нуклеиновых кислот.

Для устранения этих ограничений применяют метод, полу­ чивший название метода аналитической авторадиографии.

В этом случае для авторадиографии используют не обычные листья, а отпечатки листьев на фильтровальной бумаге, которые получают с помощью пресса. При этом протоплазма листьев впрессовывается или выбивается в фильтровальную бумагу с сохранением на ней характерного рисунка листа.

Основные возможности дифференциального в биохимическом и физиологическом отношениях учета локализации синтеза и

269

передвижения в листьях различных веществ создаются благо­ даря, во-первых, регулированию режима давления на листья (выделение плазменного и вакуолярного сока) и, во-вторых, избирательному отмыванию отпечатков листьев различными рас­ творами и растворителями. При промывании отпечатков листьев, содержащих, например, соединения, меченные 32Р и 35S, раство­ ром трихлоруксусной кислоты происходит удаление из них кис­ лотнорастворимых соединений фосфора и серы, а белки, нуклеи­ новые кислоты и лйпиды остаются на них. При промывании отпечатков спиртом, эфиром и хлороформом из них удаляются жиры, липиды, пигменты. Промывание отпечатков горячим рас­ твором трихлоруксусной кислоты удаляет из них нуклеиновые кислоты, но оставляет белки и т. д.

С таких пресс-отпечатков на бумаге можно получить авто­ радиографы, сопоставление которых дает информацию о лока­ лизации меченых элементов в важных в биохимическом отно­ шении фракциях веществ.

Этот метод пригоден также и для 1) ускоренного опреде­ ления относительной радиоактивности различных меченых со­ единений, в частности удельной активности белков, благодаря использованию отпечатков в качестве готовых, практически стандартных по толщине препаратов для радиометрии посред­ ством счетчиков; 2) ускоренного полуколичественного опреде­ ления микроконцентрации аминного азота в листьях с сохране­ нием топографической карты локализации аминного азота (путем нингидриновой реакции отпечатков листьев, обесцвечен­ ных ацетоном); 3) изучения явлений адсорбции различных мече­ ных соединений протоплазмой листьев и 4) для ботанической документации.

Использование метода авторадиографии и колориметрической индикации отпечатков листьев позволило, например, выявить активный синтез белков в проводящей системе листьев расте­ ний, адсорбционное включение 358-метионина и ^Р-фосфатов в белки и некоторые другие явления в условиях in vitro.

Ф р а к ц и о н и р о в а н и е и р а з д е л е н и е п р о д у к ­ т о в м е т а б о л и з м а . Используют весь современный арсенал препаративных аналитических методов биохимии. Изложение таких методов является предметом биохимии, и на них мы не останавливаемся. Отметим лишь одно общее важное требование к этим методам. Подобно тому как методы фиксации биологиче­ ского объекта не должны приводить к каким-либо нарушениям в распределении меченого элемента в объекте, так и методы фракционирования должны обеспечить сохранение всех соедине­ ний и их количество в процессе фракционирования и разделения смеси на индивидуальные соединения и компоненты.

Это очень трудно, но совершенно необходимо. Если требо­ вание не выполняется, то теряют смысл биохимическое и радио­ химическое исследования. Именно поэтому, в частности, хромато­

270

графический метод разделения смесей веществ нашел широкое применение в биохимии как наиболее «мягкий» метод, обеспе­ чивающий выполнение указанного выше требования. В изотоп­ ной биохимии используются все виды и разновидности хромато­ графического анализа. Поэтому специалист, приступающий к работам по применению изотопных индикаторов в биохимиче­ ских исследованиях, должен изучить и освоить методы хромато­ графии.

При более углубленных исследованиях необходимо не только знать, в какое соединение включился меченый элемент, но и определять химическое положение меченого элемента в этом соединении.

В этом случае биохимик должен освоить также методы структурной аналитической химии (в частности, органической химии), позволяющие решать эту сложную задачу. Для рас­ щепления, например, органических соединений используются различные неорганические катализаторы, а также специфиче­ ские ферменты. Постепенно расщепляя органические соединения, выделяя продукты расщепления и определяя радиоактивность, выясняют распределение меченого углерода в органическом со­ единении.

П о д г о т о в к а п р о б ( о б р а з ц о в ) д л я р а д и о м е т ­

должны быть стандартизованы. Уточним условия стандартиза­ ции радиометрических измерений при проведении биологических экспериментов.

Задача стандартизации измерений состоит в том, чтобы об­ щая активность меченого элемента в исходном состоянии (например, в питательном растворе) и в любой части биоло­ гического объекта или материала, полученного из него, была измерена в одних и тех же условиях на данном радиометри­ ческом приборе. Стандартные условия включают полную одно­ типность препаратов, предназначенных для радиометрических измерений (одинаковость их формы, размеров, толщины, агре­ гатного состояния и т. п.), одинаковое расположение препаратов по отношению к детектору (например, газоразрядному счет­ чику), строгое соблюдение постоянства режима работы радио­ метрической установки. Количественно стандартность условий измерения активности препаратов характеризуется постоянством эффективности счета — все измерения препаратов должны быть проведены при одной и той же эффективности счета (ср). В об­ щем случае соблюдение стандартных условий радиометрических измерений — не такая простая задача. Не всегда удается при­ готовить однотипные препараты для радиометрических измере­ ний. Так, при постановке вегетационных опытов с растениями в условиях водной культуры меченый элемент вводят в пита­ тельный раствор. В этом случае общую активность питательного

271

раствора измеряют приготовлением пробы радиоактивного рас­ твора определенного объема. Эту пробу помещают в какую-либо небольшую емкость: стеклянную или металлическую (из фольги) чашечку, в плексигласовую подложку с выемкой и т. п. Можно измерить активность таких препаратов в жидком со­ стоянии, но можно и высушить растворы в сушильном шкафу или под инфракрасной лампой и измерить активность сухих остатков. Необходимо избирать какой-то определенный вид препаратов, предназначенных для радиометрических измерений.

После выдерживания растений на питательном растворе с меченым элементом, уборки их и фиксации из растительного материала для радиометрических измерений изготовляют такие же препараты, как и при измерении исходной активности радио­ активного изотопа в питательном растворе. Для этого необхо­ димо произвести озоление растительного материала (сухое или мокрое) и перевести таким путем ассимилированный меченый элемент в растворенное состояние.

Из растворов, полученных при озолении растительного мате­ риала, приготовляют стандартные препараты, активность кото­ рых измеряют в стандартных условиях.

Озоление биологического материала производят, как правило, в тех случаях, когда кроме определения количества меченого элемента необходимо знать и содержание немеченого элемента

внем.

Втех же случаях, когда . экспериментатора интересует только распределение меченого элемента, биологический мате­

риал можно и не озолять, а изготовлять из него препараты в сыром или сухом виде. Например, растирают материал до состояния пасты и стандартные порции его наносят на плекси­ гласовые подложки или металлические чашечки.

В опытах с растениями часто производят грубое или тонкое измельчение растительного материала, и определенные навески такого материала наносят на плексигласовые подложки или металлические чашечки.

Для измерения исходной активности радиоактивного изотопа приготовляют искусственную смесь определенной массы нера­ диоактивного биологического материала с известным объемом радиоактивного раствора, взятого для опыта. Из такой смеси берут определенную порцию материала и изготовляют из него стандартный препарат для радиометрических измерений.

Часто меченый элемент выделяют из растворов в форме осадка с каким-либо осадителем. Например, меченый 14С кар­ бонат-ион осаждают в виде Ва14СОз. В таких случаях необхо­ димо отделять осадок от раствора и измерять его активность. Для получения стандартных препаратов осадков применяют специальные фильтровальные приборы. Осадок выделяют из раствора путем фильтрации аликвотной порции суспензии через листок фильтровальной бумаги.

272