Файл: Иваницкий Г.Р. Исследование микроструктуры объектов методами когерентной оптики.pdf

Вобщем случае изображение анализируемого поля формируется

врезультате суперпозиции световых колебании, прошедших как че­ рез объект, так и через участки препарата, соответствующие фону. При использовании когерентного освещения изображение формирует­

ся в результате сложения амплитуд, а при некогерентном освеще­ нии — в результате сложения интенсивностей (квадратов амплитуд).

При анализе многослойных препаратов, когда исследуемые ми­ крообъекты образуют некоторую пространственную структуру, «е лежащую в одной плоскости, шумовые составляющие изображения представляют собой не только элементы фона, соседствующие с ми­ крообъектом, по и те мнкрообъекты и элементы фона, которые лежат выше или ниже исследуемого микрообъекта, и вследствие конечного значения глубины фокусировки микроскопических систем, не формируют четкого оптического изображения. В этом случае про­ шедший световой поток выражается в форме

Положим для простоты, что рассматриваются участки фона и объекта, обладающие постоянной концентрацией, и что используется монохроматический световой поток. Тогда выражение (120) можно представить в виде

Ф, = Ф„ ехр (— х'хфС V <b) ехр (— Хх 0-/об*об) + Ф0 е^Р (— ХхфсФ*ф)-

( 121)

Первое слагаемое соответствует световому потоку, прошедшему препарат на участках, где находится объект, второе — световому по­ току, прошедшему препарат на участках, где имеется лишь фон.

Если обозначить Фф| = Ф0ехр(— £>ф); Ф 0б1 =Ф оехр(— П 0б );Ф 'ф 1 = = Ф0ехр(— £>'ф), то

Однако часто в микроскопических исследованиях анализируются однослойные препараты (суспензированные или давленые). Если толщина объектов мала (например, при анализе мазков), то все по­ глощающие компоненты лежат практически в одной плоскости. К а ж ­ дая точка поля таких препаратов фактически характеризуется све­ товым потоком, прошедшим либо только через объект, либо только через фон. Величина D 'ф в '(120) при этом стремится к пулю, а мно­ житель Ф'ф, в первом слагаемом выражения (122) стремится к 1. Таким образом, световой поток, формирующий микроскопическое изображение, представляет в этом случае сумму двух независимых составляющих, характеризующих световые потоки, прошедшие сквозь участки препарата, соответствующие объекту и фону:

Ф. = Фоб. + Фф1 = Ф„ ехр (— хх о3с0б*об) + Фо ехр (ххфСФ*Ф)-

69

Взаимодействие таких независимых потоков от различных точек Поля препарата может быть охарактеризовано как аддитивное в от­ ношении амплитуд (при когерентном освещении) или в отношении интенсивностей (при некогерептном освещении).

Весьма существенным при использовании методов оптимального обнаружения является вопрос о стационарности и законе распреде­ ления амплитуд шумового фона изображении.

Стационарным в широком смысле слова будем называть ми­ кроскопическое поле, в котором:

1) соблюдается постоянство математического ожидания функции, описывающей распределение интенсивности в атом ноле:

Mfff.v, //)] = const;

2) сохраняется постоянной величина дисперсии указанной функ­

ции

/у)— //)]}■ = const;

3)корреляционная функции зависит лишь от величины разности текущих координат, по не зависит от самих координат

к I, может быть заменено усреднением по координатам, то для рас­ сматриваемой совокупности микроскопических полей зрения выпол­ няется условие эргодичности

М If (*■ У)] = jim - j- Ц / (х. у) dx dy,

где S — область усреднения.

Рассмотрим условия, выполнение которых необходимо для со­ блюдения стационарности рассматриваемых двумерных функций. В биологии нарушения стационарности связаны как с методическими погрешностями, так и самой природой анализируемых препаратов.

Методические погрешности, приводящие к нарушению стационар­ ности, определяются разной толщиной приготовляемых для анализа срезов, неоднородностями фиксации и заливки, нарушением чистоты красителя и условий окрашивания (изменением pH, продолжитель­ ности и пр.), выцветанием красителя и некоторыми менее существен­ ными факторами (Л . 20, 28, 70].

Изменения параметров биологических препаратов приводит к изменениям статистических моментов. Например, увеличение объ­ ема гистологических препаратов при фиксации и заливке приводит к увеличению средней плотности и соответственно к уменьшению математиечского ожидания (при измерении пропускания).

Если характер препаратов таков, что изменяется лишь матема­ тическое ожидание, это еще не говорит о нарушении стационарности, поскольку центрирование рассматриваемых случайных процессов попрежнему позволяет применять методы анализа стационарных функ­ ций. Использование когерентных оптических систем для анализа ми-

70

кропзображений позволяет производить центрирование достаточно простыми средствами: путем блокирования в спектральной плоскости участка, соответствующего нулевым пространственным частотам.

Однако, если методические погрешности приготовления препара­ тов могут быть сведены к минимуму, нарушения стационарности, связанные с самой природой биологической структуры, неустранимы. Устойчивость статистических параметров распределений при условии их стационарности определяется протяженностью анализируемых полей. С увеличением этой протяженности эффективность статисти­ ческой оценки увеличивается, а среднеквадратичная погрешность оценки уменьшается.

Так, нарушение стационарности может быть связано с опреде­ ленным функциональным состоянием части клеточной популяции, вызывающим изменения интенсивности окраски. В работе }Л . 14]

и биологической специфики анализируемых объектов. Например, од­ ним из авторов (Л . 40] исследовались статистические характеристики давленых препаратов корешков Vicia faba структур, удобных для анализа хромосомных повреждений. Препараты готовились по стан­ дартной методике. Четырех-пятисаптиметровые корпи подвергались облучению, после чего фиксировались в фиксаторе Карнуа. Гидролиз Д Н К производился в холодной, а затем в подогреваемой соляной кислоте. После воздействия реактива Шиффа корешки помещались для размягчения в 45% -ную уксусную кислоту. Раздавливались ко­ решки с помощью специальных приспособлений и с соблюдением нужного соответствия между твердостью корешка и необходимым усилием, что обеспечивало вполне удовлетворительную однородность

па вход амплитудного анализатора АН-100. Полученные гистограммы регистрировались на бумажной ленте. На Э Ц ВМ «Минск-22» рассчи­ тывались первые четыре момента функции плотности вероятности распределения амплитуд: математическое ожидание, дисперсия, асим­ метрия, эксцесс.

Анализ пр.опзводплся на произвольно выбранных участках пре­ паратов. Для оценки степени стационарности исследуемых распре­ делений рассчитывались также математическое ожидание, диспер­ сия, срсднеквадратпческое отклонение и коэффициент вариации рас­ пределений выборочных значений математического ожидания, дис­ персии, коэффициентов асимметрии и эксцесса функции плотности вероятности распределения амплитуд.

Анализ показал, что на коэффициент вариации основных ста­ тистических характеристик особое влияние оказывают методические погрешности, связанные с приготовлением препаратов. Так, изме­ нение средней интенсивности окраски, приводящие к изменениям математического ожидания распределений, связывается с продолжи­ тельностью гидролиза ДНК. и температурой, при которой он про­ исходит, а также с качеством реактива Шиффа. Расфокусировка препарата в анализируемом поле зрения приводит к уменьшению среднего контраста изображения и соответственно к уменьшению ди­ сперсии D и среднеквадратичного отклонения а. Однородность пре­

71

парата зависит от способа раздавливания корешков п от их жестко­ сти, которая определяется продолжительностью пребывания в фик­ саторе и в уксусной кислоте.

Все указанные погрешности при тщательном контроле за методи­ кой приготовления препаратов могут быть существенно уменьшены.

При измерении серии препаратов получены средние значения коэффициентов вариации статистических моментов от 4 до 15% при

чаев гипотезу .нормальности можно считать правдоподобной с ве­ роятностью, не меньшей 0,8.

Вероятность ошибки при обнаружении биообъектов во многом определяется априорной информацией о структуре фона. При синтезе согласованных фильтров учет спектральных характеристик фона обязателен. Обыч­ но для этих целей используют энергетический спектр фона. Если обозначить S(co.v, шу) спектр заданного рас­ пределения плотности, то энергетический спектр будет

Функция (123) может принимать только положитель­ ные значения, поэтому она реализуется на фотопластин­ ке заданным распределением интенсивности. При фильт­ рации эта пластинка соединяется с голограммой Фурье эталонного изображения, содержащей функцию, ком­ плексно сопряженную спектру эталона. Обе пластинки помещаются в частотную'плоскость оптической системы. Измерение спектральной плотности фона производится в оптической системе, выполняющей преобразование Фурье, выходная плоскость которой анализируется фото­ электрическим детектором [Л. 118]. Смещенность и сте­ пень сглаживания оценки спектральной плотности фона зависят от протяженности вводимых в коллимирован­ ный пучок входных распределений, а также от размеров и формы сканирующей диафрагмы в выходной плоскости.

15.ОБНАРУЖЕНИЕ ОБЪЕКТОВ СЛУЧАЙНОЙ ФОРМЫ

Вбольшинстве задач микроскопического анализа геометрическая структура объектов, составляющих попу­ ляцию, может варьировать достаточно широко.

72