Файл: Ошкая В.П. Нингидриновые реакции.pdf

76 ГЛ. I . ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ

Важнейшим критерием целесообразности применения нингид­ риновой реакции на хроматографической бумаге для решения той или иной задачи является чувствительность реакции, опре­ деление которой по ряду специфических причин составляет большие трудности [315, 316]. Легко понять, что при использо­ вании различных методик могут иметь место значительные рас­ хождения результатов определения чувствительности [291, 305, 317—320]. Некоторое представление об открываемых минимумах отдельных аминокислот с нингидрином на бумажных хроматограммах можно получить из табл. 2, взятой из работы [319]. Для сравнения чувствительности нингидриновой реакции приводятся открываемые минимумы соответствующих реакций изатина и аллоксана. Условия применяемого хроматографического разделе­ ния и проведения цветных реакций приведены в той же работе [319]. Как видно из данных табл. 2, наиболее чувствительным реагентом для аминокислот можно считать нингидрин.

Вряде методик учитываются индивидуальные особенности

отдельных аминокислот, например орнитина [321], фенилаланина [322], триптофана [323], тирозина, цистина [324], ими-

выми реагентами не отличается от обработки обычных хроматограмм [334]. Нингидрин в электрофоретическом анализе имеет такое же важное значение, как и при методе анализа хромато­ графией на бумаге [335]. Нингидрин является самым распростра­ ненным реагентом на аминокислоты также при использовании метода хроматографии в тонких слоях [336] и при других спосо­ бах [337—339]. Проведены многочисленные исследования о нин­ гидриновой реакции а-, р-, у-, б- и других аминокислот в водной и безводной средах [175]. Обычное розовое окрашивание этих аминокислот с нингидрином в безводной уксуснокислой среде от прибавления воды меняется на синее. Однако такое изменение окраски наблюдается не у всех аминокислот [175].

По реактивности а- и е-аминогруппы лизина в нингидриновой реакции различаются между собой. На этой основе разработаны специальные методики определения к - и е-аминогрупп [247, 340] лизина и способ его связывания с а- или е-аминогруппой в пеп­ тидах [340].

Своеобразное использование способности нингидрина реаги­ ровать с р-аминокислотами нашло применение при анализе пантотеновой кислоты и ее препаратов. Для этого пантотеновая

78 ГЛ. !. ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ

С нингидрином в реакцию вступают дипептиды [343, 344], олигопептиды и полипептиды [345—350]. В щелочной среде проте­ ины, а также отдельные аминокислоты (цистеин, пролин, оксипролин, триптофан, гистидин и лизин) флюоресцируют [351].

В присутствии некоторых альдегидов первичные амины кон­ денсируются в флюоресцирующие соединения. Особенно сильно флюоресцируют продукты реакций, если конденсацию «-амино­ кислот и пептидов осуществлять в присутствии фенилацетальдегида [179]. Для установления структуры этих сложных продук­ тов реакции проведена конденсация модельного соединения из нингидрина, фенилащетальдегида и этиламина. С помощью меченых индикаторов установлено, что соотношение исходных компонентов в продукте синтеза равно 1 : 1 : 1 [180].

На основе данных УФ-, ИК-, ЯМР-, масс-спектрометрии и рентгеноструктурного анализа установлено, что флюоресцирую­ щие продукты, синтезированные из нингидрина, фенилацетальдегида и этиламина, имеют структуру оирролинона (153) и изокумарина (154) [352].

153

Способность аминокислот и пептидов вступать в трехкомтюнентную конденсацию с нингидрином и альдегидами использо­ вана для разработки флюоресцентного метода анализа амино­ кислот, который в 10—100 раз чувствительнее колориметричес­ ких методов анализа с нингидрином [180].

В упомянутых работах [179, 180] изучено большое число аминосоединений на их способность вступать в реакцию конден­ сации с нингидрином и альдегидом с образованием флюоресци­ рующих соединений.

нокислот [353, 354].

Как видно из этого далеко не полного перечня главных объектов анализа и аналитических приемов и методов, нингидриновые реакции находят очень широкое практическое примене­ ние в анализе аминокислот, пептидов и протеинов.

Р Е А К Ц И И Н И Н Г И Д Р И Н А С АНАЛОГАМИ АМИНОКИСЛОТ, П Р О И З В О Д Н Ы М И АМИНОВ И БЕЗАЗОТИСТЫМИ С О Е Д И Н Е Н И Я М И

Гидразинокарбоновые кислоты (155) являются интересными аналогами аминокислот по аминогруппе. Свободный гидразин как в водном, так и в 1,2-диметоксиэтановом растворах реаги­ рует с нингидрином [355]. Реакционные растворы имеют краснобурый цвет. Основные максимумы абсорбции в УФ-спектре продукта реакции наблюдаются при 333 и 440 нм. В пределах около 500 нм максимум абсорбции отсутствует, и, таким обра­ зом, пурпур Руэмана, или 2-[индандион-1',3/ -илиден-(2')]амино- индандион-1,3, в этой реакции не выделяется. Авторы работы [355] высказывают предположение, что при реакции нингидрина с гидразином образуется р-гидразон нингидрина, который реаги­ рует со второй молекулой нингидрина, переходя в азосоединение. Хотя реакция проводилась в присутствии хлористого олова, синтез 2-аминоиндандиона-1,3 восстановлением предполагае­ мых промежуточных продуктов не происходил. В противо­ положном случае должен был бы образоваться пурпур Руэмана [355].

а-гидразино-3-метил-«-масляной, а-гидразиновалериановой, а- гидразинофенилуксусной и рядом других гидразинокарбоновых кислот [355]. Реакция выполнялась почти в таких же условиях, как с аминокарбоновыми кислотами: в цитратном буферном растворе при рН 5 и в присутствии хлористого олова. С а-гид- разинокарбоновыми кислотами реакция проводилась в водном растворе при 100° и водно-метилцеллосольвном ( 1 : 1 ) растворе при 124°. В зависимости от условий выполнения реакции и ха­ рактера а-гидраэинокарбоновой кислоты, подобно соответствую­ щим а-аминокислотам, во всех проверенных случаях наблюда­ лось образование пурпура Руэмана с различными цветовы-ми выходами [355]. Идентификация 2-[индандион-Г,3'-илиден-(2')]- аминоиндандиона-1,3 основывалась на данных УФ-спектров про­ дуктов реакции.

По мнению авторов [355], нингидриновая реакция а-гидрази- нокарбоновых кислот начинается нуклеофильной атакой р-азота

80 ГЛ. I . ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ

а-гидразиногруппы. Гидразон нингидрина (156) изомеризуется в азосоединение (157), которое под влиянием хлористого олова претерпевает восстановительное расщепление, и образуется 2-аминоиндандион, далее дающий пурпур Руэмана.

По сравнению с нингидриновой реакцией аминокислот вместо гидролитического расщепления соответствующего кетимина в случае гидразинокарбоновых кислот протекает восстановитель­ ное расщепление. При этом декарбоксилирования, очевидно, не происходит, и отщепляется аминокислота (158).

Хотя детали механизма реакции нингидрина с гидразинокарбоновыми кислотами неизвестны и структура промежуточных продуктов не доказана, тем не менее эту реакцию можно отне­ сти к собственно нингидриновой.

Наличие фосфиновой группировки в |3- и у-положениях а-ами- нокислот не влияет на положительную нингидриновую реакцию таких аминокислот [356]. Однако очень любопытно то, что как а - (159), так и (3-(160) ам'инофосфиновые кислоты, подобно со­ ответствующим аминокарбоновым кислотам, также дают цвет­ ную реакцию с нннгидрином.