ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 04.07.2024
Просмотров: 130
Скачиваний: 0
62 ГЛ. I . ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
другие меркаптоаминокислоты, имеющие две нуклеофильные группы в молекуле, с нингидрином реагирует по двум схемам — по амино- и сульфгидрильной группам. Так как в реакциях нуклеофильного замещения сульфгидрильная группа реагирует при мерно в 300 раз быстрее аминогруппы, то реакция протекает главным образом в сторону образования производного тиазина (126) [185].
Аминогруппа промежуточного продукта (125), образовавше гося по схеме замещения с сульфгидрильной группой, взаимо действует со вторым карбонилом нингидрина, и выделяется про изводное тиазинкарбоновой кислоты (126) [185]. Промежуточный гемимеркапталь индантриона-1,2,3 (125) в отличие от 2-амино- производного 2-оксииндандиона-1,3 неспособен отщеплять воду и образовывать основание Шиффа, вследствие чего карбоксиль ная группа в конечном продукте сохраняется. Структура побоч ного продукта нингидриновой реакции с цистеином как произ водного тиазина не вызывает сомнений; она подтверждена ЯМРспектрами [185] и приготовлением производных [189].
Интересно отметить, что ленициллинамин, или р\р-диметилцис- теин, сульфгидрильная группа которого в значительной мере экранирована метальными группами, реагирует только в 7 раз быстрее соответствующей аминогруппы, и поэтому выход пур пура Руэмана с пенициллинамином выше, чем с цистеином в таких же условиях проведения нингидриновой реакции [185].
Нингидрин очень активно реагирует и с другими соединени ями, содержащими меркаптогруппы [190, 191], что используется для модификации белков нингидрином [192, 193].
РЕАКЦИИ АМИНОКИСЛОТ |
63 |
Если реакция нингидрина с цистеином проводится при рН |
6,5, |
главным продуктом реакции является оранжевое вещество неус тановленной структуры [194].
В последнее десятилетие появилось много работ, касающихся побочных реакций, которые в определенных условиях могут про текать наряду с нингидриновой реакцией фенилаланина и дру гих ароматических аминокислот. Начиная с 1961 г. Томинага опубликовал ряд работ [195—197], в которых показал, что при реакции фенилаланина с нингидрином в водно-спиртовой среде наряду с дикетогидриндилидендикетогидриндамином в качестве побочного продукта образуется синий пигмент с максимумом по глощения при 608—610 нм. Если нингидриновую реакцию фенил аланина проводить в водно-спиртовой среде с рН ниже 6,4 и про дукты реакции хроматографировать на бумаге, то кроме пурпура Руэмана обнаруживается синее вещество [198]. Этот же пигмент в подобных условиях образуется из (3-фенилэтиламина и заме щенных в фенильном кольце фенилаланинов. Спектр поглощения синего вещества имеет максимум при 603 нм [198]. Синий побоч ный продукт был выделен в чистом виде, на основе ИК-спектров •ему приписывалась структура Ы,1М-бис-[индандион-1,3-ил-(2)]сти- риламина (127) [197]. Томинага приводит следующую схему по бочной реакции собственно нингидриновой реакции с фенилаланином:
Он полагал, что аналогичный механизм имеет место и при ре акциях нингидрина с другими аминокислотами. Так как в побоч ных продуктах типа 127 содержатся остатки аминокислот, то
64 ГЛ. I . ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
образованием этих побочных продуктов можно объяснить раз личные оттенки реакционных растворов нингидриновых реакций различных аминокислот.
Производные Ы,№-бис-[индандион-1,3-ил- (2)}фенилэтиленамина (128) были изолированы при проведении реакции нингидрина в спиртовой среде с я-метокси-, я-хлор- и я-фторфениламинами [199].
оо
Эти продукты представляют собой высокоплавкие темно-зеленые кристаллы.
Судя по обстоятельной работе [198], побочные продукты, со держащие аминокислотные остатки (128), образуются в реак циях нингидрина с рядом аминокислот. Их образование ускоря ется при избытке аминокислоты, а замедляется в -водной среде и при рН выше 6,3. Так как в состав нингидриновых реагентов аминокислот часто входят органические растворители — ацетон, метилцеллосольв, спирты, пиридин и др., то с образованием по бочных продуктов вышеуказанного типа приходится, очевидно, часто встречаться.
Однако совсем недавно появилась работа [200], в которой спектроскопические данные относительно соединения 128, опуб ликованные ранее [197, 199], используются для доказательства индено-оксазиновой структуры (129) побочного продукта нингидриновой реакции фенилаланина, образующегося в спиртовой среде.
Доказательства авторов [200] в пользу оксазиновой структуры (129) побочного продукта убедительны, и, таким образом, N , N - б«с-[индандион-1,3-ил-(2)]стириламин может рассматриваться только как промежуточный продукт этой побочной реакции.
РЕАКЦИИ АМИНОКИСЛОТ |
6 5 |
Побочная реакция триптофана — аминокислоты, имеющей гетероциклический радикал ароматического характера, проте кает иначе, чем у фенилаланина и его производных [201]. Нин гидрин с триптофаном при рН ниже 2,5 реагирует таким образом, что пурпур Руэмана практически не образуется и вы деляется только желтое кристаллическое вещество — 4-карб- окси -2,3,4,5-тетрагидро-спиро-[р-кар'болин -2,2'-индандион- ( Г , 3 ' ) ] (130) [201].
130
При комнатной температуре и рН раствора около 1 желтое вещество образуется с хорошим выходом. Действие избытка нин гидрина на производное карболина (130) не приводит к обра зованию пурпура Руэмана, и, таким образом, желтый продукт не является промежуточным продуктом нингидриновой реакции [201]. Структура желтого побочного продукта нингидриновой реакции триптофана установлена на основе изучения его хими ческих свойств, приготовления производных и обсуждения дан ных ЯМР - и масс-спектров.
Из протеиновых аминокислот наиболее отличаются от всех остальных пролин и оксипролин. Они не содержат свободную первичную аминогруппу и являются карбоновыми кислотами циклических аминов. Поэтому при рассмотрении реакции нминокислот с нингидрином должна проводиться аналогия между ними и вторичными аминами, подобно тому, как выше сравни валась нингидриновая реакция «-аминокислот и первичных аминов.
Пролин и оксипролин в обычных условиях выполнения нингид риновой реакции не образуют пурпур Руэмана, а дают желтое окрашивание [8, 104]. Если реакцию проводить в водном буфер ном растворе при рН 7, то появляющаяся вначале желтая ок раска при дальнейшем нагревании переходит в темно-красную
5 — 2054
66ГЛ. I . ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
ипродукт реакции выпадает в осадок [154]. Подобным образом реагирует также а-пиперидинкарбоновая, или а-пипеколиновая, кислота [154]. Красная окраска в реакции аминокислот с нингид рином появляется также при нагревании их в уксусной кислоте. Продукт реакции окрашивается в красный цвет и в том случае, если после хроматографического разделения на бумаге пролин и оксипролин идентифицировать с нингидриновым реагентом и хроматограадмы высушивать при повышенной температуре. При постепенном повышении температуры высушивания хромато-
грамм можно наблюдать превращение желтого пятна в крас ное [155].
В работе [154] было установлено, что образование окрашенных продуктов реакции нингидрина с иминокислотами сопровожда ется декарбоксилированием иминокислот. В водной среде иминокислоты реагировали с двумя молекулами нингидрина, продук там реакции приписывалась одна из двух таутомерных структур (131 или 132) [154].
131 |
. |
132 |
|
R = * ) H ; |
б)он |
Если реакцию нингидрина с пролином и оксипролином прово дить в спиртовом растворе, то декарбоксилирование имино кислот происходит уже при комнатной температуре: с 82%-ным выходом образуются желтые кристаллы, содержащие один оста ток нингидрина и имеющие, по мнению авторов [154], структуру
133 или 134.
Было также установлено, что нагревание желтого |
монопирро- |
||
лидинпроизводного индандиона-1,3 (133 или 134) с |
нингидрином |
||
в буферном растворе с рН 7 при температуре 60—70° дает |
уже |
||
описанный красный продукт |
реакции (131 или 132) |
[154]. Обра |
|
зование красного красителя |
из желтого продукта (133 или |
134) |
|
РЕАКЦИИ АМИНОКИСЛОТ |
67 |
также наблюдается, если в последней реакции конденсации нингидрин заменить изатином, хинонами или другими карбониль ными соединениями [202]. Прибавление восстановителей к реак ционной смеси пролина и нингидрина при получении желтого продукта не влияет на их взаимодействие. Образование желтого соединения из оксипролина и нингидрина в водных растворах, содержащих смешивающиеся с водой органические раствори тели, при рН 4—8 протекает через стадию образования какого-то красного промежуточного продукта [102].
Как видно из предложенных в [154] структурных формул про дуктов (133, 134), взаимодействие нингидрина с иминокислотами рассматривалось как альдольно-кротоновая конденсация, не за трагивающая иминогруппу, что оказалось неверным. Правильные структуры продуктов реакции нингидрина с иминокислотами ус тановили другие авторы [155]. В ИК-спектрах желтого продукта, полученного из пролина, отсутствовала полоса поглощения иминогруппы, необходимая согласно формулам 133 и 134.
Физические и химические свойства продукта оказались близ кими свойствам хорошо изученного [203] енолятбетаина 2-пири- динийивдандиона-1,3 (135).
135 136
Было установлено [155], что желтый продукт реакции нингидрина с пролином, подобно 135, имеет структуру енолятбетаина 2-пир-
ролинийиндандиона-1,3 (136). |
Первый этап реакции протекает |
по общей схеме нингидриновой |
реакции: |
136
5*
68 |
ГЛ. 1. ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ |
|
Предполагаемое расщепление — N = C < ^ -связи благодаря структурным особенностям енолятбетаина не происходит, по
этому пурпур Руэмана не образуется.
Если желтый продукт реакции (136) нагревать с избытком нингидрина, то легко протекает альдольно-крото«овая конденса ция по метиленовой группе пирролиния и образуется красный продукт реакции (137), имеющий конъюгированную систему двойных связей. Методом Я М Р получены данные, подтверждаю щие правильность рассматриваемых структур желтого и крас ного продуктов [204].
о
1 3 '
Аналогично протекают реакции нингидрина с другими иминокислотами, имеющими иминогруппу в пятичленном цикле [205]. а-Пиперидинкарбоновая и другие шестичленные иминокислоты с нингидрином реагируют подобно вышеупомянутым кислотам, но в этом ряду первые продукты реакции, имеющие желтый цвет, малостабильны, поэтому удается выделить только продукты красного цвета [155]. Четырехчленная иминокислота — а-азети- динкарбоновая кислота — в реакции с нингидрином дает соот ветственно коричневый и синий продукты реакции, но в этом случае реакция, очевидно, протекает иначе [155, 206].
Высказано предположение, что реакции орнитина, лизина и оксилизина с нингидрином протекают с одновременной цикли зацией аминокислот [207]. В таком случае имеет место реакция нингидрина с циклическими иминокислотами.
3,4-Дегидропролин в противоположность пролину дает только желтое окрашивание при обработке его пятен на бумажных хроматограммах. В реакции 3,4-дегидропролина с нингидрином в водном растворе при рН 7 и небольшом нагревании интенсивно выделяется углекислый газ и осаждается бесцветный продукт [204]. Реакция нингидрина с 3,4-дегидропролином протекает сле дующим образом:
РЕАКЦИИ АМИНОКИСЛОТ |
69 |
с о о н
138
М 3
После нуклеофильного присоединения 3,4-дегидропролина к нингидрину следуют отщепление углекислоты, перегруппировка и присоединение второй молекулы нингидрина к пиррольному
циклу. Бесцветный |
продукт реакции (142) при нагревании |
теряет |
|||
молекулу воды и окрашивается в желтый цвет (204]. |
|
||||
При сравнении |
продуктов реакции нингидрина с пролином |
||||
(136, |
137) и 3,4-дегидропролином |
(141 —143) |
видно, какое |
боль |
|
шое |
значение на |
ход реакции |
оказывает |
наличие двойной |
|
V |
г / |
|
|
|
|
/ /С=С\ч ^-связи в цикле аминокомпонента.
При рассмотрении механизма нингидриновой реакции было отмечено, что эфиры и-аминокарбоновых кислот не дают харак терную нингидриновую реакцию. Более подробное изучение этого вопроса на примерах метилового, этилового, пропилового, изопропилового и н-бутилового эфиров и глицина позволило
70 ГЛ. I . ХИМИЯ НИНГИДРИНА И НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
обнаружить интересные факты. Оказалось, что «-бутиловый эфир глицина в водно-бутанольном растворе дает пурпур Руэмана быстрее, чем неэтерифициро-ванкый глицин. Авторы [208] объ ясняют это гидролизом «-бутилового эфира и образованием неионизированной аминокислоты со свободной карбоксильной группой, которая необходима для распада кетимина (144). Кетимин с неионизированной карбоксильной группой (144) рас падается быстрее, чем кетимин с ионизированной карбоксильной группой (145).
144
Таким образом, экспериментальные условия нингидриновой ре акции здесь таковы, что скорость гидролиза «-бутилового эфира глицина и нуклеофильной атаки глицина на нингидрин выше скорости установления равновесия между ионизированной и не ионизированной по карбоксильной группе молекулами глицина.
Втаких условиях перенос электронов по промежуточной форме
(144)протекает легче, чем по форме 145, и, следовательно, ско
рость образования пурпура Руэмана больше при использовании «-бутилового эфира глицина, чем при использовании глицина.
В литературе [209] имеются указания, что гидразиды «-амино кислот при нагревании с нингидрином в присутствии пиридина или аскорбиновой кислоты дают цветную реакцию с образова нием пурпура Руэмана. Гидразид изоникотиновой кислоты при комнатной температуре образует желтые кристаллы продукта присоединения, пригодного для микрокристаллоскопической идентификации гидразида [210].
С нингидрином реагируют амиды кислот, несмотря на низкую нуклеофильность аминогрупп. Так, Ван Слайком с соавторами было замечено, что гидролиз мочевины при нагревании ее сла бокислых водных растворов заметно замедляется в присутствии нингидрина [211]. Влияние нингидрина на выделение углекис лого газа при гидролизе мочевины исследовалось количественно [212]. Выделением стабильного продукта присоединения моче вины к нингидрину удалось объяснить задержку гидролиза моче вины в присутствии нингидрина. Структура продукта присоеди нения, кристаллизующегося с одной молекулой воды, изучалась спектроскопически [56, 57]; продукту было приписано строение уреида нингидрина, вернее индандиона-1,3 (146). '