Файл: Шамин А.Н. Развитие химии аминокислот.pdf

кислотам и т. д., включая важные работы отечественных ученых — В. М. Родионова [34], В. С. Гулевича и его уче­ ников [35], Н. Д. Зелинского [36],— оказались не вклю­ ченными в химию природных аминокислот белкового происхождения.

Э. Фшпер для обозначения всех детален превращений и строения оптически активных изомеров аминокислот разработал терминологию, которой до сих пор широко пользуются химики и которая повлияла иа многочислен­ ные, разработанные позднее новые классификации.

Начатые Э. Фишером работы по доказательству //-кон­ фигурации а-углеродиого атома природных аминокислот составили важную фазу развития стереохимии амино­ кислот.

Создание аналитической химии аминокислот

Накопление данных о строении встречающихся в белко­ вых гидролизатах аминокислот и их свойствах позволило Э. Фишеру перейти к разработке методов препаративного выделения аминокислот из белковых гидролизатов.

Тенденция физиологов и биохимиков исследовать продукты начального неполного расщепления белковых веществ приводила к столь противоречивым результа­ там, что ни о какой их систематизации не могло быть и речи. Получаемые при таком гидролизе смеси высокомо­ лекулярных осколков (кстати, в то время и не предпола­ гали, каков истинный молекулярный вес даже этих фраг­ ментов, не говоря уже о целой белковой молекуле) были настолько неоднородны, что попытки разделить их н тем более изучать количественно не могли увенчаться успе­ хом. Э. Фишер в соответствии со своими концепциями о построении белков из низкомолекулярных веществ, како­ выми были аминокислоты, полагал, что имеет смысл осуществить только полный гидролиз белков, но не столь глубокий, чтобы конечные продукты распада могли пре­ терпевать какие-либо существенные изменения. Эти ра­ боты послужили основой многолетних исследований ус­ ловий протекания гидролиза белковых веществ, который позволял бы наиболее объективно судить о существова­ нии тех или иных структур в составе молекул. Данные, свидетельствующие о том, что по крайней мере некото­ рые аминокислоты включаются в состав белков в онти-

77

чески активном состоянии, позволили попользовать со­ хранение оптически активных конечных продуктов в ка­ честве критерия «осторожности» гидролиза.

Первые методы определения аминокислот в гидроли­ зате сводились к методам их осторожного последователь­ ного препаративного разделения с последующим весо­ вым определением состава фракции, почти всегда видо­ измененных. Так, как разделить аминокислоты на осповаипп их различны! способности к кристаллизации не удавалось, Э. Фишер решил прибегнуть к фракцпонироваииой перегонке их эфиров. Т. Курцпус ранее пока­ зал, что эфиры аминокислот (по крайней мере глицина) не разлагаются при нагревании в вакууме. Э. Фишер об­ наружил, что этиловые эфиры многих аминокислот (моноамнпомонокарбоновых и мопоампнодпкарбоновых) мо­ гут перегоняться в вакууме без разложения. Главная трудность заключалась в разработке общего метода по­ лучения свободных эфиров аминокислот, находящихся в смеси.

Первый шаг в количественном анализе аминокислот сделали в 1900 г. А. Коссель и Ф. Кутчер, разработавшие метод выделения из гидролизатов аргинина, гистидина и лизина в чистом виде с последующим их весовым опре­ делением [37]. Метод был основан па образовании нера­ створимых солеи серебра аргинином и гистидином. Остающийся в растворе лизни мог быть количественно осажден фосфорцовольфрамовой кислотой. Серебряные соли гистидина и аргинина излагали сероводородом, тем самым аминокислоты переводили в раствор. После этого проводили дробное осаждение обеих аминокислот в виде серебряных солей: в нейтральной среде выпадала соль гистидина, а при подщелачивании — соль аргинина.

Использование хлоргидратов эфиров аминокислот по методу Т. Курциуса казалось совершенно невозможным из-за неудобств, связанных с дальнейшим переосаждеиием солей точным количеством серебра. Но Э. Фишер на­ шел очень простое, как кажется теперь, решение вопро­ са. Полученные по методу Курциуса хлоргидраты зефи­ ров аминокислот он переводил в свободные эфиры, обра­ батывая их концентрированной щелочью на холоду. Эфиры при этом заметно не омылялись [38]. Этот про­ стой и изящный прием позволил Э. Фишеру легко этерифицировать смеси продуктов гидролиза белковых моле-

78

кул. Соперник Э. Фишера Т. Курциус назвал эту рабо­

а м и н о к и с л о т в п е р в ы е о т к р ы в а л а п у т ь к

ры всех известных в то время природных п близких им аминокислот и исследовал их свойства. Он установил, что при этерификации не происходит значительной ра­ цемизации оптически активных аминокислот. Фишер определил условия перегонки отдельных эфиров, пока­ зав, что они перегоняются в вакууме без значительного разложения и эта процедура может быть использована для количественных анализов.

После проведения предварительных исследований Э. Фишер приступил к анализу белковых гидролизатов. Первое применение «эфирного метода» было осуществле­ но нм в 1901 г. при анализе казеина [40].

Препаративно-аналитический метод Э. Фишера был первым в ряду разработанных в следующие годы мето­ дов определения тем нли иным образом модифицирован­ ных аминокислот. Надо сразу же отметить, что ип один пз созданных позднее методов, вплоть до разработки хроматографических методов, не смог соперничать с ме­ тодом Фпгпера по одной единственной причине: он по­ зволял определять практически все аминокислоты, в то время как все остальные методы продолжали оставать­ ся групповыми. Этот метод не смогли заменить пли вы­ теснить вновь разрабатываемые методы качественного и количественного определения отдельных аминокислот, так как ни разу не удалось создать удовлетворительную их комбинацию для полного аминокислотного анализа. Среди последних наиболее исторически важными были эмпирически найденные цветные реакции для определе­ ния отдельных аминокислот. Некоторые пз этих реакций оставались долгое время важными пробами на белок. Их пытались также использовать для колометрпческих опре­ делений аминокислот, и в 10—30-х годах в этом направ­ лении были достигнуты существенные успехи.

Одиако попытки аналпза аминокислот в биологиче­ ском материале не приносили успеха из-за невозможно­ сти раздельного определения аминокислот в смеси в том

79

пли ином препарате, будь то гидролизат плп вытяжка пз тканей. К числу таких реакций относилась так называе­

Другой давно используемой реакцией была «ксаптопротепновая реакция» Г. Мульдера па аминокислоты, со­ держащие бензольные ядра; кроме нее широко распрост­

но, ппигидрлповоп пробе, разработанной в деталях Э. Абдергальдепом (1911 г.) [47] и не специфической для аминокислот. Реакция О. Фолина на тирозин, подвергаясь многочисленным модификациям, стала одной пз первых, широко применяемых в прикладной биохимии реакций па белки. Нипгпдриновую пробу вновь начали широко исполь­ зовать после создания распределительной хроматографии на бумаге как средство проявления ампиокпслотпых пя­ тен. Но использование этих реакций относилось уже к сле­ дующему периоду развития химии аминокислот.

С изучением качественных цветных реакций в XIX в. наиболее тесно связано исследование трппофана, цветные реакции па который, зависящие от присутствия пндолыюй группировки, были известны гораздо раньше его открытия. Дще Тпдемап и Гмелни в 30-х годах XIX в. заметили, что хлор окрашивает экстракт панкреатического сока в розовокрасный цвет. Позднее в 50-х годах ХТХ в. К. Бернар, а еще позже В. Krone описали получение цветной реакции с хлорной и бромной водой при воздействии их па разлпчпые вытяжки [ 48, 49]. На связь этпх реакций с присутствием индольпой группировки в исследуемых вытяжках указы­ вал М. Ненцкий [50]. В конце ХТХ в. исследователи, в пер­ вую очередь изучавшие протсозтл и пептоны, для чего ши­ роко использовались цветные реакции, стали давать наиме­ нования этим соединениям и пытаться представить себе этот неизвестный хромоген. Так, Р. Неймейстер писал: «Вещество, непосредственно входящее в состав продуктов пищеварения и дающее фиолетовую окраску с хлор- и бромсоедииенпями, предлагаю назвать протепнхромогеном» [51]. Против этого наименования [52] были возраже-

80

ния, ио факт его введения знаменателен как начало интен­ сивных попыток идентификации хромогена. Его приро­ дой интересовался М. Неицкпй [53], его пытался выделить К. Бейтлер [54], наконец, Д. Кураев [55] вплотную подо­ шел к выделению повой аминокислоты, полулпв, по всей вероятности, как считал Ф. Гопкгатс, монобромпроизводное триптофана.

Упомянутая выше реакция А. Адамкевича также ока­ залась реакцией на триптофан. Однако доказательство того, что это именно так, было получено Ф. Гопкинсом и С. Коулом в 1901 г. после выделения ими триптофана из гидролизата казеина [56] и доказательства его аминоки­ слотной природы. При этом они показали, что течение реакции Адамкевича зависит от присутствия примесей глпоксалевой кислоты в использованной Адамкевичем для проб уксусной кислоте. Гопкинс и Коул показали также, что после того, как происходит достаточно глубокий гидролиз белковых веществ, гидролизат дает реакцию Адамкевича. На этом основании они сделали вывод, что хромоген представляет собой достаточно просто устроен­ ное вещество, а также отметили, что иа интенсивность цветной реакции влияет характер гидролиза — наиболее удобным бьтл ферментативный (триптический) гидролиз. Гопкппс и Коул обнаружили, что окрашиваемое вещество может быть осаждено препаратами ртути, при этом в оса­ док вместе с иим выпадал только легко отделяемый ци­ стин. Очистка нового препарата после этого была доста­ точно тривиальной.

Английские химики • определили элементный состав триптофана и предположили, что он является производ­ ным скатола. Но Эллиигер после предварительных теоре­

а-амино-[3-3-индолпропионовой кислоты [57].

С выделением триптофана и установлением его строе­ ния была решена задача нескольких цветных реакций на белки и показана их аминокислотная природа. Реакцию Адамкевича стали рассматривать как качественную цвет­ ную реакцию на триптофан.

Таким образом, в' первой четверти XX в. наиболее пло­ дотворным для развития химии белка оставался эфирный метод Э. Фишера — вершина аналитической химии амино­ кислот того времени.

81