Файл: Шамин А.Н. Развитие химии аминокислот.pdf

В определении азота центральное место занимал метод И. Кьсльдаля, разработанный еще в 1883 г. [7]. Чрезвы­ чайно большую роль играл метод определения амппоазота Д. Ван Слайка, предложенный в 1911 г. [8] п его много­ численные модификации [9], разработанные в 20-х годах. Широко использовались методы определения карбоксиль­ ных групп, в том числе метод С. Соренсена [10] п другие [11], а также многочисленные модификации нипгпдрнпиых проб [12—14], разработанные в 1910—1918 гг. — все это было обязательным дополнением к любому аналитиче­ скому исследованию аминокислот.

При рассмотрении развития, методов аналитической химии аминокислот мы не будем вдаваться в детали от­ дельных методик, отсылая желающих ознакомиться с ними к специальным монографиям: Р. Блока п Д. Бол­ линга [4], Г. Митчела и Т. Гамильтона [15], к сборникам «Белки» [16] и, наконец, к ежегодникам «Успехи химии белка», регулярно издающимся с 1944 г., в которых пуб­ ликуются статьи по аналитической химии белков и аминокислот [17].

Эфирный метод Эмиля Фишера являлся логическим (ио не чисто методическим) развитием групповых мето­ дов определения аминокислот, а также методическим раз­ витием доведенных до ювелирной тонкости препаративных методик. Методу Э. Фишера предшествовали групповые методы, созданные В. Гаусмаиом (в лаборатории Ф. Гоф­ мейстера), который определил в белке три фракции азота (амидный, диампнокпслот и моиоампнокпслот) (1899 г.) [18], и А. Косселя и Ф. Кутчера (1900 г.) [19], опреде­ лявших диамипокислоты — аргинин, гистидин и лизин. Оба метода были неоднократно модифицированы, особен­ но ценный для хпмиков-белковнков метод Косселя-Кутче- ра, который за 15 лет был усовершенствован 6 раз, причем трижды самим Косселем.

Однако эти методы пе давали никакого представления об аминокислотном составе белков в целом. И только Э. Фишеру удалось создать ныне кажущуюся громоздкой и неуклюжей систему приемов, позволяющих провести полный аминокислотный анализ белковых гидролизатов.

В чем состояло нововведение Э. Фишера? Метод Кос- селя-Кутчера был основан на образовании нерастворимых серебряных солей аргинина и гистидина и сводился к дробному осаждению. Т. Курциус предложил использо-

95

вать хлоргйдраты эфиров аминокислот. Э. Фишер раз­ работал метод разгонки эфиров как основу разделе­ ния.

Методу Э. Фишера было суждено долго оставаться единственным методом анализа смесей аминокислот. Все остальные методы, проявившиеся в первые три десятиле­ тия XX в., сводились лишь к иопыткам усовершенство­ вания амииокнслотиого анализа разогнанных по Фишеру фракций п к разработке более и л и менее удобных методов определений отдельных аминокислот и л и группировок — карбоксильных, аминных и других групп. Так, метод Ф. Форемана определения аспарагиновой и глутаминовой кислот осаждением кальциевых солей спиртом, разрабо­ танный в 1914 г., возрождал забытый метод Г. Рнттхаузена 1869 г. [20, 21]. Эта методика, послужившая осно­ вой для многих модификаций, была типично групповой, дающей лишь ограниченную информацию об аминокис­ лотном составе белка.

Кроме метода Ван Слайка для определения азота амино­ групп был создай ряд методов для определения карбок­ сильных, сульфогндрильных н аминогрупп в белках. Это была еще одна группа методов, позволявшая получить сведения об общем содержании аминокислот в той или иной форме в молекуле белка, а также аминокислот в сме­ си. Так, метод формольного титрования, разработанный С. Соренсеном, позволял определять количество карбок­ сильных групп аминокислот в растворе. Этот метод полу­ чил значительное распространение, так же как и метод Ban Слайка.

Метод Р. Эягелапда (1909 г.) позволял определить аминогруппу метилированием метилиодидом в щелочном растворе:

R—СИ—NHs + ЗСГЫ + ЗКаОН -»

!1

соон

— 3NaJ + НаО + П—СН—Гч'(СНз)з

I I

со-о

Последние кристаллизовали в виде ауратов.

Предпринимались попытки превратить подобные мето­ ды в общие методы анализа аминокислот. Так, Ван Слайк создал в 1911—1913 гг. довольно сложную процедуру,

96

позволяющую определить отдельные аминокислоты в сме­ си, причем некоторые аминокислоты определяли косвенно, вычислением по группам [23, 24].

В 1928 г. Г. Дэкпп [25] предложил метод, с которым связывали большие надежды. Считалось, что он сможет заменить метод Э. Фишера. Дэкпи показал, что мопоампномонокарбоиовые кислоты можно извлечь из раствора при помощи бутилового и изопропилового спиртов. Однако метод оказался неприменимым для количественного вы­ деления аминокислот, в том числе моноаминокислот от дпамино- и дикарбоиовых кислот, т. е. именно для того, для чего ои и создавался. Эта неудача Дэкпна, большого знатока экспериментальной химии белка, еще раз показа­ ла, сколь сложен путь совершенствования способов ана­ лиза аминокислот.

В 1922 г. О. Фолии [26] предложил количественный колориметрический метод анализа аминокислот с (1-нафто- хинопсульфоиовой кислотой, по этот метод не позволял дифференцированно определять аминокислоты.

Заметные успехи в 10—30-е годы XX столетия были достигнуты в разработке методов определения отдельных аминокислот. При этом характерным было следующее: наибольшее число максимально точных и удобных методов было предложено для аминокислот с характерными боко­ выми цепями или активными группами боковых цепей — тирозина, триптофана, цистина, аргинина. Практически не продвинулось вперед по сравнению с уже существующими методами определение дикарбоиовых кислот — глутамино­ вой и аспарагиновой. Эти кислоты по-прежнему опреде­ ляли гравиметрически в виде солей со значительными потерями н ошибками. Практически только этерифика­ цией по Э. Фишеру можно было определить другие амино­ кислоты.

Таким образом, имела место определенная зависимость развития методов определения от структуры объекта: для более характерных соединений подбирались более или менее специфические процедуры. При этом далеко не все­ гда имело место совпадение устремлений химиков, изуча­ ющих структуру или аминокислотный состав белков, со­ держание или превращение отдельных аминокислот в тка­ нях и органах, с возможностями аналитической химии аминокислот. Существовала определенная зависимость этих исследований от набора методов или даже типов апа-

лпза: мы уже отмечали распространение гравиметриче­ ских методов в групповом анализе аминокислот и колори­ метрических при анализе отдельных аминокислот. Разра­ ботка того или иного приема, так же как и выбор объекта анализа, представлялась случайной, почти не зависящей от воли и желания исследователей.

После Фишера, для которого был характерен универ­ сальный подход, наиболее крупные силы ученых сосредоточплпсь в рядах аналитиков. «Исследователи аминокис­ лот находятся среди элиты науки»,— писали в 1931 г. Г. Впккерн и К. Шмпдт [27, стр. 169]. Вместе с тем теоретики, генерировавшие одну за другой гипотезы стро­ ения белка, требующие строгой аналитической проверки, почтп полностью утратили интерес к кропотливой анали­ тической работе. В результате этого в 30-е годы в основ­ ном исследуются лишь аминокислотный состав и содержа­ ние отдельных аминокислот в белках. Эти работы гораздо более прочно вошли в историю химии белка, чем много­ численные гипотезы циклического строения белковой мо­ лекулы.

Одновременно началось широкое использование мето­ дов анализа аминокислот врачамп и биохимиками. В част­ ности, прямые биохимические запросы определили появ­ ление ряда колориметрических методов определения тиро­ зина и триптофана Фолпна (О. Фолппа п В. Денниса, •1912 г.; О. Фолппа и Дж. Лунся, 1922 г.; О. Фолппа и В. Чокылтя, 1927 г.); последний метод получил особенно большое распространение.

Общий же итог трех десятилетий развития аналити­ ческой химии аминокислот был далеко не удовлетвори­ тельным. Г. Митчелл и Т. Гамильтон в своей монографии 1929 г. суммировали: «При использовании всех доступ­ ных методов только половина из девятнадцати известных аминокислот может быть определена с известной сте­ пенью точности» [8, стр. 142].

Вместе с тем развитие пептидной теории поставило вопрос о взапмоположеипп, а затем о законах распреде­ ления и последовательности аминокислот в полипептидной цепи. Успехи в области синтеза полиампнокислот (в 30—40-е годы — олигоаминокислот) [28], появление ги­ потезы «перемежающихся частот» М. Бергмана и К. Нимана и привлечение к пей широкого внимания [29] сно­ ва остро дало почувствовать отставание аналитической

98

химии аминокислот по сравнению с развитием химии бел­ ка в целом.

В 1945 г. А. Мартин и Р. Сипг, создатели метода рас­ пределительной хроматографии иа бумаге, революциони­ зировавшего аналитическую химию белка и аминокислот, признавались: «Многие усовершенствования за последнее время, несомненно, были вызваны желанием подтвердить или опровергнуть гипотезу строения белка Бергмана и Нпмана в той части, в какой она касалась полного ами­ нокислотного состава». При этом они тут же добавляли: «Современные аналитические методы едва ли способны разрешить эту задачу даже для отдельных аминокислот. Однако имеются серьезные основания полагать, что че­ рез несколько лет проблема анализа белковых гидроли­ затов или аминокислот будет разрешена в такой мере, что центр тяжести проблемы будет заключаться в соответ­ ствии состава гидролизата составу белка, из которого он получен» [30, стр. 46].

С середины 30-х годов все больше внимания обращают па способность аминокислот адсорбироваться различными веществами и на возможность использования этой спо­ собности для разделения и анализа аминокислот. Хотя отдельные наблюдения подобного рода и даже попытки включить их в качественные методики предпринимались еще во времена Фишера О. Фолиным [31], Э. Абдергальдеиом и А. Фодором [32], разработка количественных ме­ тодов на этой основе была начата лишь в годы второй ми­ ровой войны [33—35].

г Хроматография и аминокислотный анализ

История создания хроматографического анализа представ­ ляет самостоятельный интерес и заслуживает подробного изложения ’. Мы остановимся лишь па принципиальных работах, которые сделали метод хроматографии, во-пер­ вых, всеобщим, применительно к аминокислотам, вовторых, количественным и, в-третьих, позволили опери­ ровать с микроколнчествамп белка, аминокислот и белко­ вых гидролизатов.1

1 История хроматографического анализа была рассмотрена в не­ скольких работах (см., например, [36, 37]).

Все это вместо взятое послужило отправной точкой для той огромной, но проведенной исключительными тем­ пами работы по изучению аминокислотного состава белка, о цели которой В. Стейн сказал: «Для выяснения струк­ туры белка необходимо иметь точные и полные сведения об аминокислотном составе большого числа различных

созданию многочисленных, принципиально новых методов анализа аминокислот (микробиологических, изотопных и других). В начале 50-х годов революция в методах анали­ за выразилась в автоматизации аналитических процессов; после чего развитие химии аминокислот и белков приоб­ рело существенно новые черты.

Хроматографические методы для анализа аминокислот пытались применить еще в 30—40-е годы, по с качествен­ ными и препаративными целями. Одиако приложение хроматографических методов к исследованию водораство­ римых веществ отставало по сравнению с анализами жи­ рорастворимых веществ [39, 40]. Но уже к 1943 г. Т. Вилапд опубликовал обзор специально хроматографических методов анализа аминокислот [41], в котором разделил хроматографию на три группы методов: адсорбционные, обменные и распределительные. Это деление было в значи­ тельной мере условно и не совсем правильно отражало ис­ тинную классификацию хроматографических методов [42, стр. 750], по именно это деление сохранилось в описании хроматографических методов анализа аминокислот на весь рассматриваемый нами период (до конца 50-х годов XX в.). Современное определение хроматографии 2 также отличается от определения 40-х годов: хроматография — «технический прием анализа путем пропускания жидко­ сти через порошкообразное пли пористое вещество, безот­ носительно к природе физико-химического процесса, ко­ торый может приводить к разделению вещества в при­ боре» [43].

Мы привели это определение, данное создателями рас­ пределительной хроматографии, для того чтобы подчерк-

2 «Хроматография — разделение смесей газов, ларов, жидкостей или растворенных веществ сорбционными методами в динами­ ческих условиях» [42, стр. 750].

100

путь широкое толкование, имевшее хождение в описыва­ емый период.

Одно из наиболее ранних успешных разделений ами­ нокислот было осуществлено Ф. Турба в 1941 г. [44]. С помощью двух коммерческих адсорбентов типа фуллоровой земли он произвел количественное отделение гисти­ дина, лизина и аргинина от всех остальных нейтральных и кислых аминокислот. Адсорбированные и затем элюи­ рованные аминокислоты определяли по Ван Слайку, сте­ пень разделения достигала 98—100%.

В том же году для разделения аминокислот стали ис­ пользовать колонки с АЬО.ч, а также синтетические ионообменные смолы [45, 46]. В дальпейшем обменные методы были с успехом применены для разделения днкарбопопых н моноампномоиокарбоиовых кислот [47, 48]. Все перечисленные методы, несмотря па значительную чув­ ствительность, тем не мепее страдали общим недостатком, характерным п для старых гравиметрических и колори­ метрических методов,— они не были всеобщими, а остава­ лись специально разработанными для отдельных амино­ кислот пли их групп и часто капризными при изменении условий.

Поэтому в начале 40-х годов более перспективными считались «истинно адсорбционные» методы, где в каче­ стве активного вещества использовались активированный уголь и некоторые другие сорбирующие вещества, в том числе синтетические смолы. В развитие методов этого типа наиболее важный вклад внес А. Тпзелиус [49]. Од­ нако в данном случае прогресс хроматографии оказался связанным ие столько с преимуществами сорбционных приемов, сколько с изобретением новых методических при­ емов, видоизменивших технику хроматографического ана­ лиза. Тизелиус ввел фронтальный анализ и впервые ис­ пользовал технику вытеснительного проявления.

При фронтальном анализе ие использовалось обычно применяемое проявление. Исследуемая среда непрерывно вводилась в колонку с активированным углем, а вытека­ ющий раствор контролировался одним из оптических ме­ тодов, которые были разработаны в лабораториях швед­ ских химиков Т. Свсдберга и А. Тизелиуса для методов ультрацентрифугироваиня и электрофореза (см. [50]). Полученные кривые были кривыми градиента концентра­ ции, а не самой концентрации. Скорость движения фрои-

101

та данного растворенного вещества и смеси вдоль колон­ ки является функцией количества его, адсорбированного адсорбентом (па единицу веса).

В 1942 г. А. Тизелпус п С. Клессоп [5J] резко повы­ сили чувствительность метода, применив интерферомет­ рический принцип для определения показателей прелом­ ления. Метод фронтального анализа на долгий срок сохра­ нил свое значение для хроматографии бесцветных ве­ ществ, несмотря па необходимость тсрмостатировапнн п сложность аппаратуры, в том числе п измерительной части.

Значительно большие надежды связывали с методом вытеснительного проявления, предложенным А. Тизелпусом в 1943 г. [52, 53]. Он обратил внимание, что прп про­ явлении хроматограммы смеси веществ па колонках рас­ твором соответствующего сильно адсорбируемого вещест­ ва наступает стационарное состояние, прп достижении ко­ торого происходит смещение более слабо адсорбирован­ ных веществ в последовательности, зависящей от их спо­ собности задерживаться данным адсорбентом. При атом расстояние между последовательными полосами являет­ ся мерой количества, имеющегося в смеси вещества для дапных условий. •

. Этот метод был в момент создания неудобей тем, что требовал присутствия значительных количеств анализи­ руемых веществ в растворе. Тем не менее с его помощью удалось провести разделение ряда аминокислот и низко­ молекулярных пептидов. Предполагалось, что вытесни­ тельное проявление сможет превратиться в общий метод определения всех аминокислот в белковых гидролизатах.

Но все упомянутые выше методы были вытеснены соз­ данием действительно универсального метода анализа — распределительной хроматографии.

Принцип распределения по фазам растворимых в во­ де соединений был изучен Р. Сингом в конце 30-х годов. Ему удалось установить, что ацилампиокпслоты можно разделить, используя разность в их коэффициентах раз­ деления между хлороформом п водой [54—57]. Основы­ ваясь на этом открытии, А. Мартин и Р. Синг разработали метод распределительной хроматографии, которому было суждено существенно повлиять на темпы и характер ис­ следований в самых различных областях химии и, преж­ де всего, биоорганической химии и химии белка. Авторам

102

этого метода в 1952 г. была присуждена Нобелевская пре­ мия по химии.

В распределительной хроматографии, которая разра­ батывалась и была успешно применена именно в анали­ тической химии аминокислот, вместо обычного твердого адсорбента используется инертное вещество, сначала это были порошки, которые служили лишь в качестве носи­ теля жидкой фазы. Ужо в первых экспериментах в каче­ стве носителя использовался силикагель, впоследствии ставший одним из популярных носителей для многочис­ ленных хроматографических и электрофоретических ме­ тодов 3.

В качестве стационарной фазы использовалась вода с

аминокислоты через колонку наблюдалось визуально в виде красного пятна или полосы па желтом фоне. После прохождения через колонку разделенные вещества соби­ рали и титровали.

А. Гордой, А. Мартин и Р. Синг уже в 1943—1944 гг. разработали рутинный метод анализа 9 аминокислот в гидролизате 25 мг белка [60—62]. В дальнейшем метод подвергался непрерывным усовершенствованиям и был подхвачен во всех биохимических лабораториях мира.

Точпость его на первых порах составляла ± 5% , при­ чем в основном за счет потерь при ацетилировании амино­ кислот. Были испробованы многочисленные носители и комбинации растворитель — адсорбент. Наиболее важно и так же значительно по своим последствиям было приме­ нение Р. Коисденом, А. Гордоном и А. Мартином целлю­ лозы в качестве носителя [63] для множества различных подвижных фаз. Целлюлоза использовалась в виде фильт­ ровальной бумаги, на один конец которой наносились аминокислоты, а другой был помещен в кювету с раство­ рителем. Вся конструкция помещалась в закрытую каме-

3 В середине 40-х годов применение силикагеля было еще недоста­ точно освоено. А. Мартин н Р. Синг писали: «Приготовление си­ ликагеля является довольно капризным, недостаточно еще по­ нятным процессом. Трудность состоит в том, что адсорбция на силикагеле может полностью изменить цвет и область окраски индикатора и что гель, пригодный для одного индикатора, не обязательно пригоден для другого» [58, стр. 79].

103