Файл: Шамин А.Н. Развитие химии аминокислот.pdf

ру, атмосфера которой была насыщена парами воды н ра­ створителя. Капиллярные силы «высасывали» из кюветы растворитель, который затем стекал по бумаге. Отдельные аминокислоты двигались с различной скоростью, опреде­ ляемой отношением воды и растворителя п кооффнциентом распределения. Использование бумаги позволило вве­ сти так называемую двухмерную хроматографию, когда аминокислоты прогонялись по бумаге в двух перпендику­ лярных направлениях с использованием различных рас­ творителей.

Развитие разнообразных хроматографических методов повлекло за собой развитие теории хроматографического анализа, что в свою очередь способствовало созданию но­ вых многочисленных методик п модификации. На смену распределительной хроматографии пришла ионообменная. Создание новых методов привело к появлению полуавто­ матических, а затем и полностью автоматизированных аналитических устройств.

Всередине 50-х годов С. Мур, У. Стейн и Д. Спекмен

[64]в результате длительной кропотливой работы скон­ струировали первый автоматический анализатор амино­ кислот — совершенный прибор, выполнявший в течение нескольких часов работу по определению содержания аминокислот в гидролизате белка. Усовершенствование одиого из автоматических регистрирующих устройств, со­ зданных Муром п Стейном, позволило автоматизировать не только процесс анализа аминокислот, по и процесс рас­ щепления пептидов но методу Эдмаиа. Это разрешило ос­ новные трудности аналитической химии белков, так как для проведения анализов, которые раньше могли выпол­ нять только химики-аналитики высшей квалификации, затрачивая при этом огромный труд и годы работы, теперь могли привлекаться лаборанты, специализирующиеся на обслуживании автоматических устройств, причем стан­ дартизация определении значительно уменьшила вероят­ ность ошибок [64]. Хотя операции, непосредственно вклю­

чающие хроматографирование, ие были осповиыми, без их использования создание этих устройств было невозможно.

Появление первых автоматических анализаторов сти­ мулировало активность конструкторской мысли и приве­ ло к созданию семейств различных устройств, а впослед­ ствии распространилось и на другие области лаборатор­ ной практики, включая синтез белка. .

104

Развитие стереохимии аминокислот

Развитию стереохимии аминокислот в послефшнеровскпй период содействовали две различные побудительные при­ чины. Первой из них было стремление определить пли до­ казать, из каких стереоизомериых форм аминокислот по­ строены белки. Свидетельства того, что в построении полтшептпдион цепи доминируют L-амииокислоты, были по­ лучены еще в конце XIX в. Эмилем Фишером ото представ­ ление было оформлено в достаточно стройную и экспери­ ментально обоснованную гипотезу построения белков из аминокислот одинаковой конфигурации. Но при доказа­ тельстве правильности пептидной теории в то время эти представления пе играли существенной роли. Эта побу­ дительная причина преобладала до начала 30-х годов, ког­ да были собраны основные аргументы в пользу L-конфн- гурацпп природных аминокислот.

Второй причиной, существовавшей уже с 20-х годов, было развитие методов рентгеиоструктурного анализа и стремление химиков представить себе пространственные формы белковых молекул. В этих работах в качестве объек­ тов использовали и аминокислоты как элементарные структуры белка, изучение размеров и формы которых по­ зволило бы судить о строении, размерах и форме более сложных структур — пептидов и белков.

Наконец, в послевоенные годы появилась третья побу­ дительная причина, связанная уже не с познанием струк­ туры белка в целом, но с детализацией его физиологиче­ ских фупкцнопальпых характеристик. Ученые получили, наконец, возможность исследовать именно те свойства бел­ ка как компонента почти всех биологических систем, ко­ торые издавна привлекали самое большое вппмапие, но оставались недоступными, а пменпо каталитические. Ин­ терес к стереохимии аминокислот в связи с этпм несколь­ ко изменился: основное внимание сосредоточилось на по­ ложении боковой цени аминокислотного остатка относи­ тельно молекулы белка и на конфигурации пептидной группы. В то же время объектом изучения сталп конфи­ гурации многочисленных низкомолекулярных биологи­ чески активных соединений, включающих в себя амино­ кислотные остатки: антибиотики, гормоны и т. д. Роль стереохпмнческпх эффектов в проявлении их активности велика, однако она изучена мало. Это также наложило от­ печаток на развитие стереохимии аминокислот.

105

Все большее значение в связи с этим приобрели про­ блемы асимметрического синтеза и проблема стереоизомерпи живых организмов, в которой центральную роль игра­ ют «избирательный» асимметрический биосинтез амино­ кислот наравне с биосинтезом углеводов.

Все это дополнило те основные (позитивные и негатив­ ные) факторы развития стереохимии органических соеди­ нений, которые специально проанализированы Г. В. Быко­ вым в фундаментальной монографии [65].

Фишеровская стереохимия аминокислот и развиваемые им частные представления находились в теснейшей зави­ симости от его работ по стереохимии углеводов, представ­ лявших собой частный случай определения конфигурации органических соединений с асимметрическими углеродны­ ми атомами. Об исторической направленности работ Э. Фи­ шера в области углеводов (а это справедливо и в целом для стереохимии аминокислот) Г. В. Быков писал: «Определе­ ние конфигурации оптически активных соедипеипй имеет значение главным образом для установления генетической связи между ними, что особенно ясно проявилось при ис­ следовании сахаров, и поэтому не удивительно, что именно в связи с работами в этой области Фишер предложил пер­ вую схему установления такой зависимости» [65].

Применительно к аминокислотам Э. Фишер использо­ вал развиваемые их представления для установления чет­ кой связи между аланином, серином и цистином (см. стр. 75), что впоследствии распространили и на гексоиовые основания, орпитии и аргинин и т. и.

Однако, хотя сами аминокислоты были более просто устроенными стерическпмн объектами, нежели сахара4,

•* Э. Фишера интересовала прежде всего конфигурация а-углерод- ного атома; существование других асимметрических атомов уг­ лерода, как, например, у окснпролииа пли изолейцпна

.D-изолейцпп L-изолейцнн D-алло-пзолейции L-алло-изолейции

106

стереохимия Э. Фишера строилась безусловно на сопостав­ лении конфигураций различных классов.

Эта характерная и очень важная черта была утрачена в стереохимии аминокислот в последующие годы н восста­ новлена лишь в середине 30-х годов после работ Р. Купа н

К. Фрейденберга.

Вслучае аминокислот важной проблемой, гораздо более значительной, чем для ряда: моно—>-олпго—►полисахари­ ды, был вопрос о генетической связи стереонзомеров — мо­ номеров — н построенных с их участием полимеров. Эта проблема перекрывалась еще более грандиозной проблемой биогенетической связи стереоизомсрпых соединений как в биологически индивидуальных биосинтезах (онтогенети­ ческий аспект), так п в эволюционных схемах (филогене­ тический аспект). Э. Фишер безусловно отдавал себе отчет

вбиологической значимости химического решения этих вопросов в целом, но для указанной детализации время тог­ да еще не наступило.

После смерти Э. Фишера развитие стереохимии не сов­ падало с развитием частных вопросов стереохимии природ­ ных соединений. Химия белка вплоть до начала 30-х годов «не имела вопросов» к стереохимии аминокислот, кроме пе­ речисленных. II лишь тогда, когда стало очевпдпым, что важнейшие вопросы строения белковых молекул зависят от решения проблемы их размеров, формы и конфигурации, когда развитие получили методы экспериментального

определения геометрических параметров органических мо­ лекул, в первую очередь рентгеноструктурный анализ, от­ крылась новая страница стереохимии аминокислот.

Э. Фишер и его последователи провели важную предва­ рительную работу, о которой А. Нейбергер, отмечая поло­ жительные и отрицательные стороны, написал: «Как пока­ зали Фишер, Каррер, Левен и другие исследователи, мно­ гие аминокислоты, оптическое вращение которых различ­ но как по знаку, так и по величине, могут быть превраще­ ны друг в друга с помощью химических реакций, не затра­ гивающих асимметрический атом углерода. Этим путем оылп получены доказательства того, что по крайней мере по­ ловина встречающихся в белках аминокислот имеет одина­ ковую конфигурацию. Однако для целого ряда амниокис-

ему либо ие было известно, либо не исследовалось со стереохпмнческнх позиции.

107

лот такие превращения оказались неосуществимыми. Поэ­ тому для установления конфигурации ...использовали не прямые, а косвенные доказательства» [66, стр. 298—299].

Характерно, что основные доводы в пользу L-конфпгу- рацпп основных природных аминокислот были собраны Р. Куном [67] и К. Фрейдеибергом [68] в 1933 г. в фун­ даментальной работе по общей стереохимии. Это означало конец временной изоляции исследований стереохимии ами­ нокислот п начало широких исследовании в этой области.

Метод Купа и Фрейдонберга сводился к очепь осторож­ ному приложению принципа оптической суперпозиции. Ошт исходили из химической общности сравниваемых соединении, полагая, что вторичные эффекты одинаковы по знаку п близки по величине. Такой эмпирический под­ ход (введение заместителей] при контроле изменения вра­ щения) не был в достаточной мере объективным и поло­ жительные результаты могли быть получепы лишь при очепь широких исследованиях, что и осуществили Кун it Фрепдепберг. Они учитывали многочисленные методи­ ческие трудности, в частности, возможное влпяппе раство­ рителя иа оптически активные молекулы.

Для производных аминокислот неприменим метод из­ мерения вращения в газовой фазе. Немецкие химики при­ меняли такие растворители, как, например, гексан, в кото­ рых эффекты второго порядка могли быть минимальными. Они употребляли главным образом чистые оптически активные жидкости без растворителя, применяя такие про­ изводные аминокислот, у которых ассоциация минималь­ на. Основным выводом работ Куна и Фрейдонберга было признание наиболее вероятной L-коифигурацпп у природ­ ных аминокислот.

Насколько важным стал вопрос о стерической конфи­ гурации аминокислот для решения новых кардинальных проблем строения белковой молекулы, свидетельствовало появление гипотезы строения молекул глобулярных белков Д. Л. Талмуда и С. Е. Бреслера. Эта гипотеза, намного опе­ редившая аналогичные исследования, основывалась иа со­ вершенно определенных закономерностях расположения стереопзомеров аминокислот вдоль полипептпдиой цепи.

Были проведены интересные работы и получены любо­ пытные результаты при изучении конфигурации аминосахаров Г. Хеуорсом [69], что подтверждено рентгено­ структурным анализом [70].

108

Были установлены конфигурации ряда аминокислот п показана генетическая связь между ними и исходными неамныированными сахарами. Но переносить эти резуль­ таты на аминокислоты, даже на гсксоновые основания было рискованно.

С середины 30-х годов в изучении конфигурации амино­ кислот все больший вес приобретают рентгеноструктур­ ные исследования 56.

Первые анализы структуры аминокислот проводились прежде всего с целью нащупывания подходов к определе­ нию структуры белков, исходя из следующего положения: «Для объяснения свойств аминокислот, а также для выяв­ ления общих структурных закономерностей, характерных для аминокислот и пх полимеров — белков, важно знание строения отдельных молекул аминокислот, а также их воз­ можных молекулярных взаимодействии, которые могут быть выведены на основе анализа упаковки молекул в кри­ сталлах. Наиболее полные сведения по этим вопросам дает метод рептгеноструктурпого анализа» [71, стр. 15].

Начало рептгеноструктуриых исследований аминокис­ лот датируется точно — это 1931 г., когда Дне. Бериал опубликовал результаты предварительных исследований следующих аминокислот и их производных: глицина, L-алаиппа, Н-аланппа, Н-феиплаланина, L-цпстпна, моно­ гидрата аспарагина, L-аспарагпиовоп и А-глутамниовой кислот и дикетопнперазииа [72]. Им были определены размеры пространственной ячейки и пространственных групп, а также оптические свойства кристаллов. Распо­ ложение молекул в ячейке было определено приблизи­ тельно.

Одновременно Ф. Лепель с сотр. предприняли пзучеппе структуры глицина [73] В 1936 г. А.. И. Китайгород­ ский также изучил глицин, но его данные, как и данные Ленеля, оказались неверными [75].

В 1939 г. Дж. Олбрехт и Р. Кори опубликовали пер­ вые полные структуры а-модификацнп глицина [76]. О тех пор были изучены структуры большинства главных

5 Состоянию и развитию этого вопроса за последние годы (вплоть до 1965 г.) посвящена детальная монография Г. В. Гурской [71].

6 Одновременно Ф. Ленель попользовал метод дебаеграмм для до­ казательства кристаллической природы четырех пептидов из коллекции Э. Фишера, содержащих от 6 до 18 аминокислотных остатков [74].

109

«магических» аминокислот (кроме триптофана) и неко­ торых природных, а также синтетических аминокислот [71]. Эти данные имеют неоспоримое значение для сте­ реохимии органических соединении в целом, по для изу­ чения структуры белков приложение рептгеиоструктурпых данных к исследованию аминокислот и других отно­ сительно простых соединений создало парадоксальную си­ туацию. Наиболее успешно проводились сравнения струк­ тур аминокислот п фибриллярных структур белков, для которых характерно регулярное строение полппептчдной цепи (вторичной структуры). Значительный прогресс был достигнут п при определении размеров пептидной связи [77—79]. Несомненно влияние реитгеиоструктурных дан­ ных па развитие важных теоретических положений, в частности на создание теории ос-спиралп Л. Полпнгом. Но для определения структур глобулярных белков даппые о размерах и структуре аминокислот на первых порах дали незначительную информацию, а представления о значи­ тельной регулярности иолппептпдиой цепп глобулярных белков и невысокая в 40—50-х годах разрешающая спо­ собность реитгеиоструктурных измерений привели к аб­ солютизации роли спнрализнрованпых участков полипептпдной цепи в молекулах глобулярных белков [80].

Однако на решающей стадии определения структуры глобулярных белков данные рентгеноструктурного анали­ за аминокислот сыграли важную роль [81—83].

В настоящее время данные о структуре аминокислот­ ных остатков в молекуле приобрели большое значение в связи с изучением функциональных свойств белков, их активных центров [84] и конфигурации поверхности гло­ булы, что имеет немаловажное значение для решения во­ проса о строении и образовании надмолекулярных п суб­ клеточных структур, образовании четвертичной структу­ ры белка, а также о процессах самосборки [85, 86].

Работа по корреляции конфигураций а-аминокислот- после исследований Кона и Каррера была значительно' расширена7. К хпмичеекпм и физическим методам при­ бавились биологические. Были детально рассмотрены во­ просы об абсолютных конфигурациях аминокислот, от­

7 Обширную сводку литературы по атому вопросу можно пайтн в монографии Дж. Гринштейна и М. Виипца [87, глава 4], где при­ ведено 511 ссылок.

110

правкой точкой для которых послужила работа II. Бсйпута, А. Пеердемаиа п A. Ban Боммеля из Утрехта, родины стереохимии [88], применивших в 1951 г. специальную диффракцпоииую технику, использующую фазовый сдвиг вблизи края рентгеновского поглощения при определении абсолютных конфигураций D- п L-впиных кислот. Была проведена огромпая работа по определению стереохнмических соотношений большинства аминокислот, входящих в состав белков. Для этого были детализированы п моди­ фицированы многочисленные методы.

Таким образом, к 50-м годам исторически наиболее важными направлениями химии аминокислот стали ана­ литические и стереохимическпе. При этом характерна од­ на особенность: если аналитическое направление было ориентировано в осповиом па движение вперед сопредель­ ных проблем, в первую очередь химии белка, то стереохимпчесжое направление повлияло не только и не столько на подобные проблемы (конфигурация белковых молекул), сколько на мощное развитие экспериментальной, прежде всего синтетической п препаративной хпмпи аминокис­ лот. В послевоенные годы бурное развитие получшгп ме­ тоды оптического разделения аминокислот, причем созда­ ются промышленные методы получения природных изоме­ ров незаменимых аминокислот. Особенно массовым становится производство глутаминовой кислоты — важной пищевой добавки, особенно в Японии. Большое значение приобретают имеющие давнюю историю биологические ме­ тоды разделения аминокислот.

Наконец, большое развитие получает асимметрический синтез аминокислот, работы в области которого продолжа­ ют интенсифицироваться.

Положение химии аминокислот вновь изменялось. Проделав путь от изолированного направления, изучаю­ щего определенную группу азотсодержащих соединений, пройдя фазу слияния с химией белка, химия аминокислот превратилась в направление, тесно связанное с общим по­ током органохимических исследований природных соеди­ нений, направление, сохранившее характерные черты и специализированные задачи.

111