Файл: Замятнин, А. А. Дилатометрия растворов белков.pdf

Скачать файл
Заказать решение

ВУЗ: Не указан

Категория: Не указан

Дисциплина: Не указана

Добавлен: 30.10.2024

Просмотров: 54

Скачиваний: 0

ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.

<Рг.сн3/г

1

0,30 -

9 9

; !

о2

?

, ;

OSO •

. ;

 

;

т

 

!

!

?

С? ;

J!

?

!

і

 

 

 

?

0,70

 

 

1

т

с5

 

1

1

1

 

 

 

 

 

 

!

«

 

?

 

!

!

?

1

т

!

1

!

ОМ . !

!

!

|

 

 

 

 

 

<5>

S «s ïr § <a M .3 „§:

! ! \ 1 ! " T T

!

1

1

 

 

 

]

 

1

 

1

•

 

 

 

:

;

 

 

Т I

 

: т ;

 

J

 

 

;

!

 

 

!

1

т

!

!

1

!

 

 

!

!

і

 

•

 

1

'

•

1

 

!

!

'

!

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

і

'

?

 

!

!

!

!

і

!

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

!

'

!

 

 

!

t

!

1

 

1

 

 

1

 

 

 

!

1

!

1

1

1

1

!

1

1 I

 

 

 

 

1

 

I

1

1

1

 

1

!

1

 

 

 

1

1

 

1 1

1 1

 

1 I 1 1 . 1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

'53

<o

 

 

 

 

 

 

 

 

 

^

 

.S

'S

 

'S

 

5

t

 

 

 

 

 

Мол

 

ßec

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Р и с . И . Величины кажущихся удельных объемов амітокнслотных остатков, располо­ женные в порядке возрастания их мольных весов

1 — аминокислотные" остатки, принимаемые за полярные; г •— неполярные аминокислот­ ные остатки

29

м о л е к у л я р н ы ми взаимодействиями белка. Эти взаимодействия могут стать другими в процессе физико-химических реакций и таким образом оказать влияние на величину полного объема бел ­ ка. Иначе говоря, смена конформации белка может приводить к проявлению объемных эффектов. Проверке этого предположения будет посвящен раздел V I I .

Кроме того, разрыв сильных пептидных связей

в белке, к о ­

торый происходит при гидролизе, т а к ж е приводит к

образованию

новой системы (или систем) внутри- и межмолекулярных взаимо ­ действий. Поэтому наблюдение объемных эффектов следует ожи ­ дать при осуществлении процессов и такого типа.

Детально объемные эффекты, связанные с разрывом и перерас­ пределением различных связей (взаимодействий), будут нами рассмотрены в последующих разделах.

I I I

Д И Л А Т О М Е Т Р Ы Д Л Я И С С Л Е Д О В А Н И Я Б Е Л К О В Ы Х РАСТВОРОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИЛАТОМЕТРИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ

Дилатометрия я в л я е т с я прямым методом измерения изменений объема раствора. Пр и дилатометрических измерениях исследуе­ мый раствор (или растворы) помещают в некоторый сосуд, и изме­ нения объема системы регистрируют по смещению одной из поверхностей жидкой среды в заданном направлении [6].

Очевидно, что способ регистрации перемещения свободной по­ верхности может быть самым различным . Д л я этого можно ис­ пользовать емкостные [51], пьезоэлектрические [52, 53], оптиче­ ские [54] или какие-либо другие датчики. Дилатометры, снабжен­ ные такими датчиками (часто называемые волюмометрами), об­ ладают обычно высокой чувствительностью, и с их помощью можно производить измерения быстрых изменений объема,-завер­ шающихся в пределах 1 сек.

Физико-химические реакции в растворах белков, исследовав­ шиеся до настоящего времени дилатометрически, характеризуются длительностью в несколько десятков секунд и более. (В качестве редкого исключения можно привести, п о ж а л у й , работу по иссле­ дованию быстрого изменения объема раствора гемоглобина А пр и присоединении окиси углерода [55], выполненную с использова­

нием пьезоэлектрического

датчика [53].) Поэтому исследователи

использовали дилатометры

с к а п и л л я р н ы м датчиком, в е р х н я я

граница

частотной характеристики которых обычно составляет

~ 10 гц

[53].

 

Д л я

осуществления прецизионных измерений изменений объе­

ма системы необходимо, чтобы был удовлетворен целый ря д тре­ бований. Одно из основных требований изотермической дилато­

метрии состоит в том,

что дилатометрическая

система должна

быть соответствующим

образом

термостатирована. Естественно,

что степень термостабилизации

определяется

чувствительностью

дилатометра и объемом жидкости в системе (объемом кюветы). Современные капиллярные дилатометры обладают чувствитель­ ностью 10~4 —10_ 6 см3. Предположим, что коэффициент объемного расширения белковых растворов по п о р я д к у величины равен коэф­ фициенту объемного расширения воды, который вблизи 20° С сос­ тавляет примерно 2-10"4 г р а д - 1 . [18]. Тогда, очевидно, чтобы из -

Зі

бежать ошибок, вызванных тепловыми помехами, изменения тем­ пературы системы объемом 10 см 3 не д о л ж н ы выходить за пределы + 0,005° С при чувствительности дилатомера ~ 10 5 см 3 . Следует отметить, что при проведении неизотермических измерений необ­ ходимо вводить поправку на расширение самого дилатометра. Чтобы избежать этого, можно использовать сразу два одинаковых дилатометра: один, содержащий исследуемый раствор, а другой — контрольный, содержащий только растворитель, т. е. измереипя производить по дифференциальной схеме.

Баростатирование дл я дилатометра обычно не столь

необхо­

димо по сравнению с термостатированием.

Действительно,

если

мы снова обратимся к воде, коэффициент сжимаемости

которой

вблизи

20° С составляет

около

5-10~5 а т м Г 1

[18], то при объеме

кюветы

дилатометра ~

10 см 3

изменение атмосферного

давления

на 1 мм рт. ст. приведет к проявлению эффекта порядка 5-10- 7

см 3 .

При рассмотренной нами чувствительности 10~5 см 3 эта величина пренебрежимо мала. Однако при использовании дилатометров с более высокой чувствительностью (10 _ 6 см 3 ) и при длительных из­ мерениях изменение величины атмосферного давления может вно­ сить свой вклад в получаемый результат, что необходимо учиты­ вать прп его обработке.

Источником ошибок в дилатометрии может служить также при­ сутствие пузырьков воздуха в исследуемом растворе [56]. Вслед­ ствие этого растворы непосредственно перед введением в дилато­ метр (или в самом дилатометре) необходимо подвергнуть обезгаживаиию . В этой процедуре удобно использовать роторный испа­ ритель с ловушкой. Кроме того, для предотвращения вспенивания и таким образом для сохранения нативного белка лучше произво ­ дить обезгаживание не белкового раствора, а только растворителя (до растворения в нем белка).

Н а результаты измерений может также оказывать влияние степень чистоты внутренней поверхности дилатометра, в особен­ ности, к а п и л л я р а . Промывку можно производить последовательно спиртовым раствором едкого к а л и , хромовой смесью, водой, спир­ том п эфиром [57]. Разумеется, что следует принимать во внима­

ние н к а п и л л я р н ы е свойства

жидкости, заполняющей к а п и л л я р

дилатометра. Испарение этой

жидкости т а к ж е в ряде случаев мо­

жет повлиять на искомый результат измерений. Проблема выбора

капиллярной жидкости будет рассмотрена нами ниже.

Определение диаметра

к а п и л л я р а , от которого зависит

чув­

ствительность

дилатометра, можно производить различными

спо­

собами. Наиболее простым и точным способом определения

сред­

него

диаметра

к а п и л л я р а

служит метод ртутного столбика.

Д л я

этого

к а п и л л я р заполняют

некоторым количеством ртути и изме­

ряют длину образовавшегося ртутного столбика.

Пр и этом жела ­

тельно измерить длину столбика в разных частях

к а п и л л я р а , что-

'бы удостовериться в постоянстве величины среднего

поперечного

сечения на длине столбика. После этого ртуть столбика

взвешивают

32

и, используя значения длины столбика и плотности ртути, рассчи­

тывают

диаметр

к а п и л л я р а .

Чувствительность дилатометра

за­

висит,

очевидно,

не только

от диаметра к а п и л л я р а ,

но и цены

деления измерителя положения мениска к а п и л л я р н о й

жидкости .

Диаметры капилляров варьируют в пределах 0,2—1 мм, а цена

де­

ления соответствующего измерителя (обычно катетометра пли отсчетного микроскопа) составляет 0,1—1 мм.

Величина измеряемого изменения объема зависит от величины объемного эффекта, характеризующего исследуемую физико-хи­ мическую реакцию данного белка, от концентраций исследуе­ мого белка и других компонентов раствора, а т а к ж е от величины объема кюветы дилатометра. Величины различных объемных эф­ фектов, которые характеризуют белковые растворы, будут нами рассмотрены в последующих разделах. Отметим только, что де­ тальное исследование этих эффектов обычно требует использова­ ния кюветы дилатометра объемом 10—100 см 3 и концентрации бел­ ка 1—50 мг/мл.

Существует т а к ж е еще целый ряд требований, которые необ­ ходимо предъявлять к определенным операциям при дилатометри­

ческих

измерениях

и к самим дилатометрам.

Эти требования бу­

дут разобраны при

рассмотрении конкретных

видов дилатомет­

ров.

 

 

 

 

ПРОСТЕЙШИЕ КАПИЛЛЯРНЫЕ ДИЛАТОМЕТРЫ

Самый

простой дилатометр представляет собой систему, состоя­

щую из сосуда, предназначенного для заполнения исследуемой жидкостью, и к а п и л л я р а , выполняющего роль измерительного

элемента (датчика). Такой дилатометр схематически

изображен

на рис. 12, а

[58—62]. Характерной его особенностью я в л я е т с я

то,

что

к а п и л л я р 3 введен

в

сосуд

1 через

з а к р ы в а ю щ у ю

пробку

2.

При

наладке

методики

работы

с к а п и л л я р н ы м и

дилатометрами

особое внимание должно быть уделено подбору

хорошей смазки

для плотиой подгонки поверхностей горла сосуда

и пробки . Опи­

санный вид

дилатометра

многократно

использовали

д л я иссле­

дования различных жидкостей и растворов, в том числе

белковых,

а также д л я наблюдения процессов набухания сухих

белков .

 

Разновидностью дилатометра, изображенного на рис. 12, а,

является дилатометр (рис. 12, б)

с капилляром, отведенным

п р я ­

мо из сосуда

[63].

 

 

 

 

 

 

 

 

Использование дилатометров указанного типа затруднено не­

удобным процессом закрывания сосуда 1 пробкой 2.

В с в я з и с

этим были разработаны конструкции (рис. 13), в которых

п р и

закрывании сосуда 1 пробкой 2

имеется

возможность

выводить

часть раствора через специальную отводную т р у б к у [64]. В

 

не­

которых случаях эта же трубка может с л у ж и т ь в качестве залив ­ ной.

2 А. А. Замятнин

33

Смотрите также файлы