ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 05.05.2024
Просмотров: 287
Скачиваний: 0
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Ферменты, трансформирующие фукоиЬаны
В настоящее время информация о ферментативной трансформации фукоиданов, равно как и самих ферментах, принимающих в ней участие, чрезвычайно ограничена. Теоретически на фукоиданы может воздействовать достаточно большое количество ферментов разной специфичности: фуканазы, сульфатазы, галактаназы, маннаназы, ксиланазы, различные гликозидазы и т.д. Это могут быть как ферменты высоко специфичные к определенным структурным фрагментам субстрата, так и комплексы ферментов, которые могут совместно действовать на фукоиданы определенной структуры.
Несмотря на трудности, связанные с многообразием и сложностью структур фукоиданов, интерес к ферментам, катализирующим те или иные их превращения, постоянно растет. Он обусловлен возможностями использования ферментов в установлении структуры субстратов, для получения более простых биологически активных фрагментов фукоиданов, более подходящих для создания БАД или лекарственных препаратов.
ФукоиЬаназы. Распространение фукоиданаз
Классификация фукоиданаз до сих пор отсутствует, так как самих ферментов выделено немного. По состоянию на 2011 год в базе данных BRENDA содержатся сведения о 19 источниках фукоиданаз. Для большинства источников показано, что они могут синтезировать ферменты, гидролизующие фукоидан из той или иной бурой водоросли, при этом сведения о структуре субстрата часто очень ограничены, либо вообще отсутствуют. Только из одного источника был получен гомогенный препарат фермента, для двух ферментов изучена специфичность ( Colin et al., 2006, Kusaykin et al., 2006).
Учитывая структуру фукоиданов, имеющих основную цепь, построенную из остатков a-L-фукозы, связанных а-1^3 или а-1^4 связями, фукоиданаз может быть, по крайней мере, две. Первая должна катализировать гидролиз а-1 ^3 гликозидных связей между остатками фукозы в молекулах фукоиданов, вторая - а-1^4.
Фукоиданазы обнаружены в морских беспозвоночных и морских бактериях. В представителях наземной фауны и микроорганизмах фукоиданазы не найдены. Существует несколько публикаций, посвященных распространению фукоиданаз в морских бактериях — эпифитах бурых водорослей и ассоциантов голотурий (Бакунина и др., 2000) и морских беспозвоночных Японского моря (Кусайкин et al., 2003) (Табл. 2.3).
К настоящему времени фукоиданазы выделены из морских микроорганизмов (Vibrio sp. N-5 (Furukawa et al., 1992), Flavobacteriumsp. SA-0082, FucoidanobactermarinusSI-0098 (Sakai et al., 2002)), морских про-теобактерий
(PseudoalteromonascitreaKMM 3296, KMM 3297, KMM 3298 (Бакунина и др., 2002)), морских беспозвоночных Haliotussp. (Thanassi and Nakada, 1967), Patinopecten yessoensis (Kitamura et al., 1992) Littorina kurila (Кусайкин и др., 2003)), морского ежа Strongylocentrotus nudus (Sasaki et al., 1996). Ранее было отмечено присутствие фукоиданазы, наряду с другими О-гликозид гидролазами, в экстракте гепатопанкреаса морского моллюска Littorinasp. (Elyakova et al., 1968). Подобный комплекс ферментов был найден и в кристаллическом стебельке моллюска Telescopiumtelescopium(Alexander et al., 1979).
51
Таблица 2.3 Распространение фукоиданаз среди морских бактерий
и беспозвоночных Японского моря
Таксон | Общее количество образцов | Количество образцов, синтезирующих специфичные ферменты | Общее количество активных образцов | ||
LcF* | FeF** | LcF, FeF | |||
Бактерии | |||||
Acinetobacter | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 |
Alteromonas/ Pseudoaltero monas | 30 | 2 | 1 | 16 | 19 |
Bacillus | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
Corineforms | 6 | 1 | 1 | 3 | 5 |
Cytophaga/ Flexibacter | 14 | 3 | 0 | 5 | 8 |
Flavobacterium | 20 | 5 | 0 | 8 | 13 |
Micrococcus | 5 | 1 | 1 | 1 | 3 |
Pseudomonas/ Halomonas | 6 | 1 | 0 | 5 | 6 |
Vibrio | 6 | 1 | 0 | 2 | 3 |
Неидентифи-цированные | 8 | 1 | 0 | 4 | 5 |
Всего | 97 | 16 | 4 | 44 | 64 |
Беспозвоночные | |||||
Cnidaria | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
Sipuncula | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
Arthropoda | 4 | 1 | 1 | 2 | 4 |
Molluska | 15 | 0 | 4 | 9 | 13 |
Echinodermata | 11 | 1 | 5 | 5 | 11 |
Chordata | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 |
Всего | 33 | 2 | 12 | 17 | 31 |
*— фукоидан из L. cichorioides, сульфатированный 1->3-а-Ь-фукан
** — фукоидан из Е evanescens, сульфатированный 1->3;1->4-а-Ь-фукан
52
Выделение и очистка фукоиданаз
Основные схемы очистки фукоиданаз из различных организмов представлены в табл. 2.4. Все известные схемы включают осаждение сульфатом аммония, ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию и отличаются многостадийностью и использованием весьма чувствительных методов разделения белков, таких как изоэлектрофокусирование и хроматофокусирование. Несмотря на использование самых современных методов очистки ферментов, в большинстве работ авторы получили частично- или высокоочищенные препараты фукоиданаз. Сообщений о выделении гомогенных фукоиданаз, необходимых для установления структуры, практически нет, за исключением фукоиданаз из гепатопан-креаса Patinopectenyessoensis(Kitamura et al., 1992) и штамма бактерии Vibriosp. N-5 (Furukawa et al., 1992), лишь для одной фукоиданазы, выделенной из бактерии FlavobacteriaceaebacteriumSW5, была установлена аминокислотная последовательность (Colin et al., 2006).
Таблица 2.4
Схемы очистки фукоиданаз
Источник выделения, ссылка | Схема выделения | Субстрат |
Vibrio sp. (Furukawa et al., 1992) | 1. Экстракция 2. Сульфатное осаждение (60%) 3. Хроматография на DEAE-Toyopearl 650M 4. Гель-фильтрация на сефакриле S-300 HR 5. Хроматофокусирование | фукоиданы из К. crassifolia Cladosiphon decipiens Futomuzuku |
Flavobacterium sp. SA- 0082 (Pat. USA 6277616, 2001) | 1. Экстракция 2. Сульфатное осаждение (90%) 3. Анионообменная хроматография на DEAE- сефарозе FF 4. Гидрофобная хроматография на фенил-сефа- розе CL-4B 5. Гель-фильтрация на сефакриле S-200 или S-300 6. Гидрофобная хроматография на фенил-сефа- розе HP | фукоидан из К. crassifolia |
53
Patinopecten yessoensis (гепатопанкреас) (Kitamura et al., 1992) | 1. Экстракция 2. Фракционирование сульфатом аммония 30%, 70% 3. Анионообменная хроматография на DEAE- Toyopearl 650 М 4. Изоэлектрофокусирование 5. Гель-фильтрация на сефакриле S- 300 HR | фукоидан из Nematocystus decipiens |
Strongylocetrotusnudus(пищеварительная система) (Sasaki etaL, 1996) | 1. Экстракция 2. Сульфатное осаждение 3. Хроматография на DEAE-Toyopearl-650 M 4. Хроматография на сефарозе FF 5. Гель-фильтрация на сефакриле S-200 | 2-сульфо-а-1-фукопиранозил- (1-»2) -пириди-ламинид-фукоза |
Haliotussp. (гепатопанкреас) (Sasaki etaL, 1996) | 1. Экстракция 2. Сульфатное осаждение (30-70%) 3. Хроматография на КМ-сефадексе А-50 | фукоидан из Fucus gardneri |
Littorinakurila (гепатопанкреас) (Кусай- кин и др.., 2003) | 1. Экстракция 2. Сульфатное осаждение 3. Хроматография на DEAE-Toyopearl-650 M 4. Хроматография на сефарозе FF 5. Гель-фильтрация на сефакриле S-200 | фукоидан из F. evanescens |
Pseudoalteromonas titrea (Bakunina et al., 2002) | 1. Экстракция 2. Сульфатное осаждение 3. Хроматография на DEAE-Toyopearl-650 M 4. Хроматография на сефарозе FF 5. Гель-фильтрация на сефакриле S-200 | фукоидан из F. evanescens |
Сведения о свойствах и специфичности фукоиЬаназ
Несмотря на интерес к фукоиданам, фукоиданазы остаются слабо изученными ферментами. В большинстве случаев для фукоиданаз определены лишь некоторые свойства: рН-оптимум, рН-стабильность, температурный оптимум, температурная стабильность, молекулярная масса, предположен тип действия и частично охарактеризованы продукты ферментативного гидролиза. Фукоиданазы, выделенные из различных источников, отличаются друг от друга своими физико-химическими
54
характеристиками и ферментативными свойствами (табл. 2.5). Их молекулярные массы варьируют в пределах от 39,5 кДа (Furukawa et al., 1992) до 460 кДа (Sakai et al., 2002). Изоэлектрические точки лежат как в кислой, так и в щелочной области рН. Фукоиданазы отличаются друг от друга также рН оптимумами действия. Для фермента из S. nudusон расположен при рН 3 (Sasaki et al., 1996), фермент из Fucoidanobactersp. SA-0082 наиболее активен при рН 5-9. рН-Оптимумы активности фукоиданаз моллюсков расположены в интервале от рН 5,0 до 9,0 (Kitamura et al., 1992; Thanassi and Nakada, 1967). В целом, рН-оптимумы ферментов из беспозвоночных находятся в более кислой области по сравнению с оптимумами рН ферментов, выделенных из бактерий.
Установлено, что фукоиданазы морской бактерии Vibriosp. N-5 и морского моллюска Haliotissp. ингибируются ионами Ag+ и двухвалентных металлов (Hg2+, Fe2+, Mn2+) (Furukawa et al., 1992; Thanassi and Nakada, 1967). ЭДТА, ионы Cu2+, Pb2+ не влияют на активность этих же ферментов, тогда как ионы Со2+, Mg2+ слабо активируют их активность.
Таблица 2.5 Физико-химические свойства фукоиданаз
Источник | Фермент, изо-форма | Тип действия | Т-оптимум, °с | рН-Оптимум | рН-стабильность | Pi | Mr, кДа |
Vibrio sp. No. 5 | El E2 E3 | экзо экзо экзо | 38-45 38-45 38-45 | 6,0 6,0 7,5 | 4,0-9,0 4,0-9,0 4,0-9,0 | 5,80 5,75 7,65 | 39,5 68,0 68,0 |
'Fucanobacter lyticus' SN-1009 | El | эндо | 30-35 | 6,5-8,0 | н.о. | н.о. | 100,0 |
55
Pseudoalteromonas citrea KMM 3296, KMM 3297, KMM 3298 | El | ЭНДО | н.о. | 6,5-7,0 | н.о. | н.о. | н.о. |
Mariniflexile fucanivorans SW5 | El | ЭНДО | 20-25 | 7,5 | н.о. | н.о. | 105,0 |
Patinopecten yessoensis | El | ЭНДО | н.о. | n.d | н.о. | 7,4 | 85,0 |
Haliotis sp. (rena-топанкреас) | El | ЭКЗО | 38 | 5,4 | 2,0-10,0 | н.о. | 100,0-200,0 |
Littorina kurila | El E2 | ЭНДО | н.о. н.о. | 5,4 8,5 | н.о. н.о. | н.о. н.о. | н.о. н.о. |
Strongylocentrotus nudus | El | ЭКЗО | 45 | 3,0-4,0 | 2,0-5,0 | н.о. | 130,0 |
н.о. — не определено
Температурные оптимумы большинства известных фукоиданаз лежат в области 38—45°С. Молекулярные массы ферментов эндо типа действия ниже, чем у ферментов экзо типа, что характерно и для других групп О-гликозид гидролаз.
Исследование и сравнение специфичности фукоиданаз затруднено из-за отсутствия субстратов с установленной структурой, структурного разнообразия последних, а также из-за сложностей, связанных с выделением индивидуальных ферментов.
Известно, что продуктами действия фукоиданаз на фукоиданы являются сульфатированные фукоолигосахариды, точная структура которых чаще всего не была установлена (Furukawa et al., 1992;
56