ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 05.05.2024
Просмотров: 197
Скачиваний: 0
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Kitamura et al., 1992; Pat. USA 6207652, 2001, Pat. USA 6277616, 2001). Возможно, что все известные фукоиданазы различаются по специфичности, так как в качестве субстратов при их изучении использовались фукоиданы, выделенные из разных источников, структура и моносахаридный состав которых значительно различаются.
Более подробные данные о структуре олигосахаридов — продуктов действия фукоиданазы из F. marinusSI-0098 на фукоидан из Kjellmaniellacrassifolia, приведены в работе (Pat. USA 6277616, 2001). Трисахаридные фрагменты — продукты, выделенные из инкубационной смеси, содержали галактозу, связанную а-1^3-гликозидной связью, D-маннозу, которая является точкой разветвления, имеющей в качестве заместителей D-глюкуроновую кислоту, связанную с маннозой (3-1^2-гликозидной связью, и L-фукозу, связанную а-1^3-гликозидной связью. Выделен также пентасахарид, содержащий D-маннозу, связанную а-1^3-гликозидной связью с глюкуроновои кислотой, и ряд других олигосахаридов (Pat. USA 6277616, 2001). Почти все продукты ферментативной реакции имеют на невосстанавливающем конце остатки 4-дезокси-£-эритро-гекс-4-енопиранозилуроновую кислоты, а на восстанавливающем конце — маннозы или ее сульфатированных производных. Авторы предполагают, что в фукоидане из К. crassifoliaприсутствуют чередующиеся дисахаридные фрагменты, построенные из глюкуроновои кислоты и маннозы. Вполне вероятно, что в выделенном из Е marinusSI-0098 препарате фермента наряду с фукоиданазой присутствует лиаза, которая расщепляет О-гликозидные связи по механизму (3-элиминирования. На это указывает присутствие среди продуктов реакции олигосахаридов, имеющих двойную связь в остатке глюкуроновои кислоты на невосстанавливающем конце.
Интересно, что ферментный препарат из морской бактерии F. marinusSI-0098 катализирует расщепление других фукоиданов, выделенных из бурых водорослей сем. Laminarinaceae — Undariapinnatifidaи Lessonianigrescens(Sakai et al., 2002).
В работе Furukawa (Furukawa et al., 1992) была предпринята попытка исследовать специфичность выделенных из штамма бактерии Vibriosp.N-5 фукоиданаз. Показано, что выделенные фукоиданазы (Е-1, Е-2 и Е-3) с одинаково высокой скоростью расщепляли фукоидан из К. crassifolia, несколько хуже - фукоидан из Cladosiphondecipiens, a Futomuzuku-фукоидан вообще не подвергался действию фермента.
Специфичность действия фукоиданаз из морской протеобактерии Pseudoalteromonascitrea(штаммы KMM 3296, KMM 3297, KMM 3298) была исследована (Бакунина и др.., 2002) при помощи фукоиданов из
57
Laminariacichorioidesи F. evanescens, различающихся структурными характеристиками (Табл. 2.2). Фукоидан из L. cichorioides(1^3-a-L-фукан) содержит в 2 раза больше сульфатных групп, чем фукоидан из F. evanescens(1^3;1^4-а-Ь-фукан). Фукоиданазы бактериальных штаммов КММ 3297 и КММ 3298 эффективнее катализировали расщепление фукоидана из L. cichorioides, тогда как ферменты штамма 3296 — фуко-идана из F. evanescens. При действии фукоиданаз из этих источников образовывались высокосульфатированные продукты с молекулярной массой от 1 кДа до 3,5 кДа, заметного количества фукозы и дисахари-дов не образовывалось. Авторы полагают, что исследуемые штаммы синтезируют фукоиданазы эндо-типа действия (Бакунина et al., 2002).
При действии щелочной фукоиданазы из L. kurila(pH 8,5) на фукоидан из F. evanescens(Кусайкин и др., 2003) выход низкомолекулярных сульфатированных продуктов (12>п>2) оказался в три раза выше, чем при действии на него кислой формы фукоиданазы. Это может быть связано с возможностью существования субстрата в протонированной и непротонированной формах. Под действием фукоиданазы при рН 5,4 из L. kurilaна фукоидан из L. cichorioidesобразуется в 3 раза меньше низкомолекулярных сульфатированных продуктов (12>п>2), чем при гидролизе фукоидана из Fevanescens(Кусайкин и др., 2003). Это может быть обусловлено большей доступностью для фермента О-гликозидных связей в низкосульфатированном фукоидане из F. evanescensпо сравнению с высокосульфатированным фукоиданом из L. cichorioides.
Для установления типа расщепляемой связи авторы (Kusaykin et al., 2006) выбрали продукты ферментативного расщепления фукоидана из F. evanescens, полученные под действием фукоиданазы штамма КММ 3296 и фукоиданазы из L. kurilaпри рН 8,5. Использованная в этой работе в качестве субстрата фракция фукоидана из F. evanescensотличалась от раннее описанной в работе Bilan (Bilan et al., 2002). По данным метилирования (Kusaykin et al., 2006) 1^3-связей в ней больше, чем 1^4- в 3,5 раза. В продуктах напротив, преобладали 1^4-связи. (1^3)-а-1-Фукан из L. cichorioidesтакже в небольшой степени подвергался гидролизу обоими ферментами. Из этих экспериментов следует, что в фукоиданах оба исследуемых фермента катализируют гидролиз доступных 1^3-связей и соответственно, являются (1^3)-а-Ь-фуканазами.
При действии препарата фукоиданазы из морского моллюска Littorinakurilaна фукоидан из бурой водоросли Fucusdistichus
происходило расщепление некоторого количества гликозидных связей субстрата, но ни фукоза, ни низшие олигосахариды не образовывались (Билан и др., 2005). Главным продуктом является полисахарид,
58
построенный из повторяющихся дисахаридных звеньев -*3)-а-Ь-Fucp-(2,4-di-S03)-(1^4)-a-L-Fucp-(2S03)-(l^ и практически не отличающийся по структуре от исходного вещества. В качестве минорного компонента выделена полимерная фракция с углеводной цепью такого же строения, но содержащая сульфатные группы только в положениях 2 и ацетилированная по положениям 3 и 4 остатков фукозы. Вероятно, в этом случае ферментативный гидролиз фукоидана происходит только по гликозидным связям несульфатированных остатков фукозы, содержание которых в исходном полимере весьма невелико. Очевидно, что участки молекул исходного полисахарида, отклоняющиеся от его усредненной структуры, собраны в блоки, в которых сконцентрированы неполностью сульфатированные и ацетилированные повторяющиеся звенья.
В литературе имеются сведения о трансформации фукоидана под действием частично очищенного препарата фукоиданазы из гепато-панкреаса Pectenmaximus. (Daniel et al., 1999). Исследуемый ферментный препарат катализировал деградацию фукоидана из A. nodosum. Авторы показали, что при действии фермента на фукоидан в качестве продукта реакции образуются фрагменты с молекулярной массой около 3 кДа. Моносахаридные остатки в этих фрагментах соединены а-(1^3)-связью, кроме того, имеется 1^4-связанная фукоза. Сульфатные группы присоединены по С2 и, возможно, по С4 положениям остатков фукозы. В исследованной фракции также содержатся не-сульфатированные (1->3)- и (1^4)-связанные остатки a-L-фукозы (Daniel et al., 1999). Авторы этой работы не делают заключений о типе гидролизуемой связи.
Таким образом, в настоящее время исследованы несколько фукоиданаз из различных источников, определены их физико-химические характеристики, для некоторых их них установлен тип действия и специфичность. Остается надеяться, что трудности, связанные с выделением, определением активности и экспрессией генов фукоиданаз со временем будут преодолены, фукоолигосахариды, полученные методом ферментативной трансформации нативных фукоиданов будут выделены, их структура и механизм действия расшифрованы.
Исследование структурных особенностей фукоиданов методом масс-спектрометрии
В ТИБОХ ДВО РАН для исследования структуры фукоиданов практически впервые были использованы современные масс-спектрометрические (МС) методы. В процессе разработки этих методов возникало много проблем, связанных как с химией фукоиданов, так и с техникой масс-спектрометрического анализа. Например, МС-анализ имеет ограничения по молекулярным массам веществ, поэтому для фукоиданов необходимо было разработать методы фрагментации, причем с учетом их структурных особенностей. Подбор условий получения спектров в каждом отдельном случае требовал индивидуального подхода. В результате применения масс-спектрометрии для исследования структуры фукоиданов была получена информация, либо хорошо согласующаяся с уже известными выводами, сделанными с помощью независимых методов, что показывает полную адекватность масс-спектрометрических методов, либо совершенно уникальная информация, которую классическими подходами получить невозможно. В перспективе методы масс-спектрометрии в сочетании с различными методами фрагментации, в том числе и ферментативными, могут значительно упростить установление структуры таких сложных полисахаридов, как фукоиданы. Поэтому мы сочли необходимым в монографии посвятить отдельную главу масс-спектрометрии.
Устройство масс-спектрометра
Масс-спектрометрия представляет собой современную фундаментальную и прикладную физико-химическую область науки. В её задачу входит получение знаний о составе веществ, их структуре, физико-химических свойствах, а также происходящих с ними процессах. Функционально масс-спектрометр состоит из четырех блоков — источника ионов, масс-анализатора, детектора и системы управления (рис. 3.1).
Исследование структурных особенностей фукоиданов методом масс-спектрометрии
В ТИБОХ ДВО РАН для исследования структуры фукоиданов практически впервые были использованы современные масс-спектрометрические (МС) методы. В процессе разработки этих методов возникало много проблем, связанных как с химией фукоиданов, так и с техникой масс-спектрометрического анализа. Например, МС-анализ имеет ограничения по молекулярным массам веществ, поэтому для фукоиданов необходимо было разработать методы фрагментации, причем с учетом их структурных особенностей. Подбор условий получения спектров в каждом отдельном случае требовал индивидуального подхода. В результате применения масс-спектрометрии для исследования структуры фукоиданов была получена информация, либо хорошо согласующаяся с уже известными выводами, сделанными с помощью независимых методов, что показывает полную адекватность масс-спектрометрических методов, либо совершенно уникальная информация, которую классическими подходами получить невозможно. В перспективе методы масс-спектрометрии в сочетании с различными методами фрагментации, в том числе и ферментативными, могут значительно упростить установление структуры таких сложных полисахаридов, как фукоиданы. Поэтому мы сочли необходимым в монографии посвятить отдельную главу масс-спектрометрии.
Устройство масс-спектрометра
Масс-спектрометрия представляет собой современную фундаментальную и прикладную физико-химическую область науки. В её задачу входит получение знаний о составе веществ, их структуре, физико-химических свойствах, а также происходящих с ними процессах. Функционально масс-спектрометр состоит из четырех блоков — источника ионов, масс-анализатора, детектора и системы управления (рис. 3.1).
| | | | Система | | | | |
| | | | управления | | | ||
| | | | | | | ||
Исследуемое | Источник | | Масс- | | Детектор | |||
вещество * | иоь | юв | W | анали | затор | W | | |