ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 05.05.2024
Просмотров: 297
Скачиваний: 0
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Технология получения фрагментных ионов, названная «диссоциацией, индуцированной столкновениями» или ДИС (от англ. collision-induced dissociation (CID), была применена к депротонированным, протони-рованным (или заряженным катионами щелочноземельных металлов) молекулам нативных олигосахаридов или их поизводных с использованием методов ИЭР (Duffin et al., 1992; Linsley et al., 1994, Phillips et al., 1993; Reinhold et al, 1995) и МАЛДИ МС (Cancilla et al, 1996; Perreault, Costello, 1994; Spengler et al, 1994). На фрагментацию олигосахаридов значительное влияние оказывает следующий набор факторов: метод ионизации, масс-анализатор, моносахаридный состав, тип связей, природа заместителей и др. Тем не менее, в процессе фрагментации наблюдается ограниченное число серий фрагментных ионов, что дает возможность их систематизировать.
Номенклатура, используемая для описания продуктов масс-спектрометрической фрагментации углеводов
Номенклатура, предложенная Домоном и Костелло (Domon, Costello, 1988), была разработана для описания различных фрагментов, получаемых при масс-спектрометрической фрагментации гликоконъюгатов, вне зависимости от метода их получения (рис. 3.5).
66
Y2 Z2 ' X] Yj Zj Y0 Z0
Невосстанавливающий
z
Y2 Z2 ' X] Yj Zj Y0 Z0
Невосстанавливающий
| | "°Ч к | |
| A | ||
| sr_ | у | г |
| 1™ OH | | |
в, с,
zr—' Восстанавливающий
Рис. 3.5. Номенклатура, используемая для описания продуктов
масс-спектрометрической фрагментации гликоконьюгатов,
предложенная Домоном и Костелло
Ионы, сохраняющие заряд на агликоне (восстанавливающем конце для олигосахаридов), обозначаются в случае разрыва моносахаридного кольца — X, при разрыве Ci^O гликозидной связи — Y и при разрыве О^Сх гликозидной связи — Z. Ионы, сохраняющие заряд на невос-станавливающем кольце, обозначаются А, В, С. Численные индексы справа внизу для X, Y, Z от 0 и далее обозначают порядок моносаха-ридных остатков, начиная от агликона (восстанавливающего конца). Численные индексы слева вверху обозначают место разрыва связей в моносахаридном кольце и начинаются с наименьшего по порядку атома углерода (или кислорода) из двух разрывающихся связей, начиная с О (рис. 3.5). Напротив, численные индексы для ионов А, В, С начинаются с цифры 1 и считаются с невосстанавливающего конца (терминального моносахарида). В случае соединений с разветвленной углеводной цепью, вводятся дополнительные индексы а, (3 и т.д., причем индексом а обозначается самая длинная углеводная цепь.
Масс-спектрометрическая фрагментация сульфатированных олигосахаридов в режиме регистрации отрицательных ионов
Как уже было отмечено, особенности метода ИЭР МС позволили
обойти ограничения масс-спектрометрии МАЛДИ при анализе олигосахаридов
, содержащих большое число кислотных остатков. В режиме регистрации отрицательных ионов практически не происходит отрыва лабильных кислотных групп, и формируются многозарядные ионы, дающие в режиме МС/МС наиболее интенсивные фрагментные ионы, отражающие информацию о типе связи, последовательности, разветвлениях и местах присоединения кислотных остатков и других заместителей. В связи с этим при изучении анионных поли- и олигосахаридов исполь-
67
зование тандемной ИЭР МС является предпочтительным.
Первая системная работа по изучению позиционных изомеров суль-фатированной фукозы с помощью тандемной ИЭР масс-спектрометрии, совмещенной с капиллярным электрофорезом, была выполнена группой французских ученых. Тиссо с коллегами в 2006 году, взяв за основу предыдущие работы по изучению позиционных изомеров сульфатированных гексоз (Karlsson et al., 1996; Minamisawa, Hirabayashi, 2005), установили, что, на основании данных ИЭР МС/МС, полученных в режиме регистрации отрицательных ионов, возможно различить 2-0-, 3-0- и 4-О-сульфатированные изомеры фукозы (Tissot et al., 2006). Сульфатированная фукоза (в положениях С2 и С4) дает характеристичные °'2Х- и 02А-ионы, в то время как 3-О-сульфатированная фукоза дает только анион HS04- в качестве основного продукта фрагментации. На основании данных компьютерного моделирования и МС/МС экспериментов был предложен механизм образования фрагментных ионов, представленный на рисунке 3.6.
А
\------ОН OSC?
т£139Да
/f^&
В
Н ^ KSO,1
иА97Да
0,ВСн'
С.л-
«-'-II ;
) Он
m/z183 Да
Рис. 3.6. Предполагаемые механизмы образования фрагментных ионов из сульфа-тированной фукозы в условиях ДИС МС/МС (режим регистрации отрицательных ионов). А, Б и В — схемы фрагментации 2-0-, З-О- и 4-О-сульфатированной фукозы с образованием соответственно 0,2Х-иона с m/z139 Да, эпоксида и аниона HS04- с m/
z
97 Да и 0ДА-иона с m/z183 Да
68
Предложенный механизм формирования 0,2Х- и 0,2А-ионов включает разрыв связей между атомами С1 и 0-5, ведущий к образованию открытой кето-формы с последующей перегруппировкой МакЛафферти (McLafferty F.W. et al., 1982), характеризуемой разрывом связи между атомами С2 и СЗ пиранозного кольца фукозы (рис. 3.6., А и В).
Отсутствие 0,2Х- и 0,2А-ионов при внутрикольцевом разрыве для З-О-сульфатированной фукозы показывает, что атом водорода при гидроксильной группе атома СЗ играет ключевую роль в формировании 0,2Х- и 0,2А-ионов в процессе фрагментации, что согласуется с более ранними исследованиями (Minamisawa, Hirabayashi, 2005; Carroll et al., 1995). Отсутствие 0,2Х- и 0,2А-ионов также подтверждают исследования (1 ^3)-связанных сульфатированных дисахаридов, полученных из гепарина (Saad, Leary, 2004) и хондроитина (Desaire, Leary, 2000).
Таким образом, использование тандемной масс-спектрометрии в режиме регистрации отрицательных ионов позволяет определить последовательность моносахаридов в олигосахаридах. Установление типа связи и положения заместителей также доступно с помощью этого метода. Однако установить аномерную конфигурацию гликозидных связей и различить диастереоизомеры не всегда возможно без химической или химико-ферментативной модификации исследуемых объектов.
Применение масс-спектрометрии для исследования фукоиданов
Масс-спектрометрический анализ был применен нами для исследования фукоиданов, синтезируемых бурыми водорослями, обитающими в морях Дальнего Востока России.
Методы фрагментации фукоиданов
Структурные особенности сульфатированных полисахаридов, таких как хондроитинсульфаты, гепарины и каррагинаны, успешно исследуются современными МС-методами с МАЛДИ и ИЭР ионизацией.
Для МС-анализа необходимы методы фрагментации полисахаридов до олигосахаридов подходящих размеров, что достигается, в основном, благодаря наличию доступных ферментов, эффективно и специфично катализирующих расщепление сложных полисахаридных молекул (Harvey, 1999; Zaia, 2004). Для фрагментации сульфатированных полисахаридов используют также частичный кислотный гидролиз. Полученные олигоса-хариды, несущие информацию о строении исходного полимера, выделяют и анализируют. Например, Р. Даниель с коллегами использовали 0.75 мМ H
2S04 при 60°С для гидролиза фукоидана с последующим выделением олигосахаридов и анализом с помощью ИЭР MCn (Daniel et al., 2007). Для
69
непосредственного анализа сложных реакционных смесей нами были применены как ИЭР МС, так и МАЛДИ МС, причем последний метод оказался более информативным, поскольку обладал низкой чувствительностью к нежелательным примесям и более высокой чувствительностью к полианионным компонентам в смесях за счет продуцирования только однозарядных ионов в источнике (Anastyuk et al., 2010).
Для фрагментации сульфатированных полисахаридов можно применять автогидролиз, представляющий собой, по сути, мягкий кислотный гидролиз с участием собственных сульфатных групп (находящихся в Н+-форме) в качестве источника кислоты. При этом структура образующихся олигомеров может зависеть от положения сульфатных групп в исходном полисахариде. Так, при исследовании сульфатированного галактана из красной водоросли Gigartinaskottsbergiiс помощью ЯМР-спектроскопии и МАЛДИ МС был использован указанный способ получения олигосахаридов (Ciancia et al., 2005). Автогидролиз проводили при концентрации полисахарида 10 мг/мл 11 часов при 60°С. При автогидролизе каррагинанов расщеплялась гликозидная связь между остатками 2-0-сульфат-3,6-ангидро-аТ)-галактозы и 4-0-сульфат-(ЗТ)-галактозы или 2,6-О-дисульфат-а-галактозы и 4-0-сульфат-(3-галактозы (Ciancia et al., 1991; Noseda, Cerezo, 1993; Stortz, Cerezo, 1987; Stortz, Cerezo, 1991). В процессе расщепления гликозидной связи наблюдалось отщепление сульфатной группы в положении С2. Гликозидные связи между остатками З.б-ангидро-а-Б-галактозы также расщеплялись, но с меньшей скоростью. Продукты фрагментации отдельного полисахарида, полученные автогидролизом и частичным кислотным гидролизом также могут различаться из-за различной чувствительности связей в условиях используемого метода.
Для сульфатированных полисахаридов широко применяется сольволиз как наиболее щадящий метод при необходимости их десульфатирования. Однако особенность структуры фукоиданов такова, что даже в условиях сольволитического десульфатирования происходит разрушение, как правило, большей части их молекул и выход подходящей для установления строения высокомолекулярной фракции (например, для метилирования) составляет от 7 до 40% (Bilan et al., 2002, Усов, Билан, 2009) от нативного полисахарида. Таким образом, теряется большая часть информации (часто до 90%) о строении фукоиданов. Нами впервые метод сольволиза был классифицирован как метод деградации фукоиданов и с помощью МС-методов для установления деталей структуры были проанализированы низкомолекулярные продукты, образующиеся при их сольволитическом расщеплении (Anastyuk et al., 2009, Шевченко и др., 2007).