ВУЗ: Не указан
Категория: Не указан
Дисциплина: Не указана
Добавлен: 05.05.2024
Просмотров: 208
Скачиваний: 0
ВНИМАНИЕ! Если данный файл нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам.
Высокосульфатированная подфракция CcFl-f-1,5 составляла около 70% от исходного фукоидана (CcFl-f) (табл. 5.3). Около 90% от суммы моносахаридов этой подфракций были представлены Fuc и Gal в соотношении 1,0:0,28. Основную часть подфракций CcFl-f-1,5 составили фукоиданы со средней молекулярной массой 160 кДа, в меньшем количестве — 70 кДа.
118
ю.о
15.0
20.0
мин
Рис. 5.3. Молекулярно-массовое распределение подфракций CcFl-f-0,5 (а) и CcFl-f-1,5 (б) фукоидана из водоросли C.costata. (Колонки (7,5 мм х 300 мм) Shodex Asahipak GS-520 HQ и GS-620 HQ)
Следовательно, фракция CcFl содержала, как минимум, фукоиданы двух структурных типов — слабозаряженный уро-нофукоманнан и высо-косульфатированный галактофукан в весовом соотношении 1:2.
Наличие различных структурных типов в составе общих фракций фукоиданов было отмечено для других видов водорослей. При фракционировании сульфа-тированного полисахарида, выделенного из F. vesiculosus(Sigma), авторы получили фукоиданы различного строения. Как основной компонент был выделен типичный фукан, содержащий только сульфатированную фукозу, как минорный компонент — низкосульфатированный гетерополисахарид, содержащий кроме фукозы другие моносахариды и высокий процент уроновых кислот (Nishino et al., 1994, Fitton, 2005).
При экстрагировании водоросли Adenocytisutricularisраствором соляной кислоты при 20°С получили галактофукан, который показал высокое ингибирующее действие против вирусов герпеса HSV-1 и HSV-2. Продукты экстракции при температуре 70°С содержали уронофукан, который противовирусной активности не проявлял. Фракция уронофу-кана, кроме фукозы, характеризовалась высоким содержанием уроновых кислот и маннозы, другие моносахариды находились в ней в минорных количествах. Фракция отличалась сравнительно низкими молекулярными массами (Ponce et al, 2003). Hemmingson с соавторами (Hemmingson et al., 2006) выделили из Undariapinnatifida(цельное растение, в котором спорофиллы составляли 30% от общего веса) при комнатной температуре с выходом 4,5% суммарный полисахарид, который показал высокое ингибирующее действие против вирусов герпеса HSV-1 и HSV-2. При фракционировании полисахарида ионообменной хроматографией были получены 2 фракции F1M и F2M в соотношении 1,0:3,5, которые показали разное противовирусное действие. Более сульфатированная фракция галактофукана (F2M)
показала высокое ингибирующее действие
119
против вируса герпеса HSV-1, практически аналогичное исходному образцу. Авторами также было установлено, что полисахарид продолжал показывать высокую активность против вируса герпеса HSV-1 при соотношении фракций F1M и F2M как 1:3, так и 1:1. При изменении соотношения фракций, равное 3:1, ингибирующее действие смеси полисахаридов против вируса герпеса HSV-1 уменьшилось вдвое.
Оптимизация условий выделения фукоиданов из дальневосточной бурой водоросли Fucusevanescens
Извлечение веществ из растительного сырья является сложным физико-химическим процессом, на протекание которого влияют несколько факторов. При разработке технологии необходимо определять оптимальные условия для экстракции с максимальным выходом однородного по составу продукта.
Оптимизацию условий экстракции фукоидана проводили на примере бурой водоросли F. evanescens. В дальневосточных морях эта водоросль является наиболее перспективным сырьем для получения фукоидана, представляющего собой сульфатированный фукан. В качестве сырья использовали сухую, предварительно обработанную органическими растворителями, водоросль, которая содержала до 14% фукоидана (далее по тексту — сырье).
В предварительных экспериментах были выбраны следующие условия экстракции фукоидана из сырья: средний размер частиц сырья — 5 мм, кислотность экстракционной среды рН 2,5, отношение водоросль: экстрагент — 1:15, температура — 50°С, кратность экстракций — 2 (Имбс и др., 2012). Для проверки степени влияния каждого из этих факторов на процесс экстракции фукоидана был проведен оптимизационный эксперимент по типу дробной реплики с двумя уровнями пяти переменных (25 2) с определяющими контрастами (Пономарев, 1976). Задача оптимизации сводилась к определению значений условий экстракции, обеспечивающих максимальный выход фукоидана и минимальное содержание сопутствующих веществ. План и результаты факторного эксперимента приведены в таблице 5.4.
Таблица 5.4 План и результаты факторного эксперимента (с двумя уровнями пяти переменных) по оптимизации экстракции фукоидана из F.
evanescens
опыта | Факторы эксперимента | Yi, % | Y2, % | Y3, % | Y4, % | |||||||||
Хо | Xi,PH | л2, раз | Хз.ч | Х4,°С | л5, мм | | | | | |||||
1 | 1:15 | 1,5 | 3 | 2 | 65 | 2 | 78,0 | 27,4 | 45,1 | 88,4 |
120
2 | 1:15 | 3,5 | 3 | 2 | 35 | 8 | 55,6 | 21,9 | 76,9 | 46,0 |
3 | 1:15 | 1,5 | 1 | 2 | 35 | 8 | 46,0 | 14,9 | 69,2 | 62,0 |
4 | 1:15 | 3,5 | 1 | 2 | 65 | 2 | 44,2 | 15,0 | 76,4 | 54,0 |
5 | 1:15 | 1,5 | 3 | 4 | 35 | 2 | 52,6 | 21,2 | 46,8 | 74,2 |
6 | 1:15 | 3,5 | 3 | 4 | 65 | 8 | 94,8 | 26,4 | 93,4 | 54,0 |
7 | 1:15 | 1,5 | 1 | 4 | 65 | 8 | 70,0 | 19,5 | 65,9 | 76,0 |
8 | 1:15 | 3,5 | 1 | 4 | 35 | 2 | 35,2 | 13,1 | 84,8 | 44,2 |
9 | 1:15 | 2,5 | 2 | 3 | 50 | 5 | 49,0 | 19,4 | 64,1 | 56,4 |
10 | 1:15 | 2,5 | 2 | 3 | 50 | 5 | 62,0 | 18,4 | 70,3 | 67,4 |
11 | 1:15 | 2,5 | 2 | 3 | 50 | 5 | 48,0 | 20,6 | 54,7 | 60,0 |
12 | 1:15 | 2,5 | 2 | 3 | 50 | 5 | 50,0 | 19,4 | 65,0 | 57,0 |
Выход процесса Y (функция отклика) определяли, как Y — выход фукоидана (% от содержания в сырье); Y2 — выход экстрактивных веществ (% от веса сырья); Y3 — выход водорастворимых полисахаридов (% от веса экстрактивных веществ); Y4 — выход фукоидана (% от веса водорастворимых полисахаридов). Независимыми переменными (X) были: Х0 — соотношение сырье: экстрагент; X — значение рН; Х2 — кратность экстракции, раз; Х3 — продолжительность экстрагирования, ч; Х4 — температура, °С; Х5 — степень измельчения сырья, мм.
Для определения ошибки эксперимента было поставлено 4 опыта в нулевых условиях (опыты 9-12, табл. 5.4).
По результатам факторного эксперимента описание функции отклика в виде линейных уравнений регрессии имели вид: Y1= 59,6 - 2,1 Х1 + 10,7 Х2 + 5,8 Х3 + 9,9 Х4 + 7,1Х5 (1)
Y2= 19,9 - 0,8^ + 4,3 Х2 + 0,6 Х3 + 1,7 Х4 + 0,8 Х5 (2)
Y3= 69,8 + 13,1 Xj + 4,3 Х2 + 0,8 Х3 + 2,5 Х4 + 6,5 Х5 (3)
Y4= 62,4 - 12,8 Xj + 3,3 Х2 + 2,2 Х3 + 3,3 Х4 - 2,8Х5 (4)
Проверка значимости коэффициентов при факторах X в уравнениях (1-4) по критерию Стьюдента (с надежностью 95%) показала, что в уравнении (1) и (2) значимо отличны от нуля только коэффициенты при Х2, Х4 и Х5, а в уравнениях (3) и (4) - при Хг
Это означает, что в выбранном диапазоне величин фукторов увеличение кратности (Х2) и температуры экстракции (Х4) должно приводить к увеличению выхода фукоидана (Y ) и экстрактивных веществ (Y ). При увеличении рН среды (Х:) следует ожидать повышения доли полисахаридов в экстрактивных веществах (Y ) и уменьшения доли фукоидана во фракции полисахаридов (Y4). Поскольку уменьшение размера частиц сы-
121
рья (X ) при статическом режиме экстракции не приводило к повышению выхода фукоидана, рекомендовано сырье измельчать до размера 1—3 см.
Как показали результаты регрессионного анализа уравнения (1), оно удовлетворительно описывает выход фукоидана в процессе экстракции. Экспериментальная проверка модели в условиях иных, чем те, которые использовались для получения уравнения (1), подтвердила адекватность ее применения для описания процесса (F3Kcn = 5,42; Бта6л = 5,79; р = 0,05).
Для масштабирования процесса экстракции фукоидана из Е evanescensнеобходимо учитывать следующие закономерности. На выход фукоидана положительно влияло повышение температуры экстракции. Однако, учитывая, что экстрагирование проводят при достаточно низких значениях рН, повышение температуры выше 70°С может привести к частичному кислотному гидролизу фукоидана. Увеличение кратности экстрагирования также положительно влияло на выход фукоидана. Изменение рН в заданном интервале (1,5—3,5) влияло на выход фракции водорастворимых полисахаридов и содержание фукоидана в этой фракции. Варьируя значение рН от 1,5 до 3,5 и выше можно получать фракцию полисахаридов с разным содержанием фукоидана и альгина-та. Для получения фракции полисахаридов, обогащенной фукоиданом, экстракцию следует проводить при рН 2,0—2,5.
Была проведена 3-х кратная экстракция сырья при 65°С, результаты опыта приведены в таблице 5.5. Составы 1 и 2 экстрактов практически идентичны и их следует объединить. При необходимости получения гетерогенного фукоидана можно проводить 3-ю экстракцию, выход которой составляет 12% от суммарного выхода.
По результатам оптимизации были выбраны условия экстракции фукоидана: рН 2,5; при 65±5°С; кратность экстракции два раза по 3 ч, гидромодуль 1:15; при этом содержание фукоидана в сумме экстрактивных веществ составило от 40 до 50%.
Для очистки фукоидана F. evanescens от ламинарана и низкомолекулярных примесей использовали ультрафильтрацию на мембранах с пределом удерживания 5 кДа. Одновременно с очисткой экстракта происходило его концентрирование. Конечный продукт получали осаждением фукоидана из концентрата этиловым спиртом. Характеристика экстрактов приведена в таблице 5.6. В результате очистки был получен препарат, содержащий 86,7% фукоидана (табл. 5.6).
122
Таблица 5.5 Характеристика экстрактов, выделенных