Файл: Аутентичного материала.docx

137

ческой активности. Это свойство позволяет рассматривать фукоиданы как потенциальное средство для рассасывания тромбов. Дальнейшие исследования показали, что нативный фукоидан из этого вида водоросли увеличивал активность плазминогена invitro, а дополительно сульфатированный фукоидан - ингибировал или не оказывал влияния на этот процесс (Lang et al., 2004; Hall et al., 2006).

Таким образом, сульфатированные полисахариды из бурых водорослей, сочетающие в себе свойства антикоагулянтов, ингибиторов тромбина, фибринолитиков, перспективны для клинического использования и представляют альтернативу гепарину. Приведенные данные свидетельствуют о том, что фукоиданы обладают разносторонней фармакологической активностью и с успехом могут быть использованы для создания новых БАД к пище и лекарственных препаратов.

Наши исследования касались механизмов антикоагулянтного действия фукоиданов, выделенных из бурых водорослей Охотского моря Е evanescensи S. cichorioidesв тестах invitroи invivo(Кузнецова и др., 2003; Дрозд и др., 2006).

При изучении влияния фукоиданов из F. evanescens(I) и S. cichorioides(II) на показатели свертывания крови (нормальной плазмы здоровых доноров) в базовых коагуляционных тестах invitroвыявлено дозозависимое увеличение времени свертывания по показателям АПТВ- ТВ- и ПВ-тестов.

Пролонгирование показателей АПТВ- и ПВ- тестов свидетельствует об эффективном влиянии фукоиданов I и II на механизмы внутреннего и в меньшей степени — внешнего — путей свертывания. Значительное удлинение ТВ, характеризующего конечный этап свертывания или превращение фибриногена в фибрин под воздействием тромбина, свидетельствует о влиянии фукоиданов на этот процесс и предполагает воздействие на тромбин.

В связи с этим нами исследована ингибиторная активность фукоиданов по отношению к тромбину (фактору Па) и к фактору Ха. В частности, проведен анализ специфических антикоагулянтных активностей фукоиданов: удельной антитромбиновой (alia) активности и удельной активности против фактора Ха (аХа). Способность антикоагулянтных препаратов к торможению активности фактора Па (тромбина) и активности Ха является их важной характеристикой, особенно в отношении средств, применяемых для профилактики тромбообразования.

При исследовании invitroбыли установлены следующие показатели ин-гибиторной активности фукоиданов по отношению к тромбину (фактору Па): от 22±7 до 29±6 ЕД/мг для фукоидана из

---

Е evanescens(I) и от 43±8 до 49±8 ЕД/мг для фукоидана из S. cichorioides(II), по отношению к активи-

138

рованному фактору X (Ха): от 28±7 до 66±10 ЕД/мг для I и от 31±8 до 83±7 ЕД/мг для П. Отношение aXa/alla составило 1,3—2,3 для I и 0,7—1,7 для II, что является показателем терапевтического эффекта и свидетельствует о перспективности практического применения исследуемых фукоиданов в качестве антикоагулянтных и антитромботических средств.

Дальнейшее исследование механизмов антикоагулянтного действия фукоиданов, а именно изучение возможности прямого антитромбино-вого действия фукоидана из F. evanescensили способности тормозить самосборку фибрин - мономера проводили путем оценки его влияния на свертывание очищенного препарата фибриногена тромбином. При анализе полученных нами результатов установлено отсутствие антикоагулянтного эффекта под влиянием фукоидана в диапазоне концентраций от 1 до 1000 мкг/мл, что характерно и для внесения в такую тест-систему гепарина. Это позволило нам предположить, что прямым антитромби-новым действием фукоидан не обладает, а его антикоагулянтное действие обусловлено активацией AT III, т.е., как и гепарин, фукоидан не является прямым ингибитором тромбина, а действует опосредованно, через какой-либо компонент плазмы.

Для проверки данного предположения было предпринято исследование антикоагулянтного действия фукоидана в присутствии AT III и без него с использованием тест-системы с хромогенным субстратом, специфичным по отношению к тромбину.

Результаты данного исследования показывают, что оптическая плотность в смеси фукоидана в концентрации 100 или 1000 мкг/мл, тромбина и хромогенного субстрата, не содержащей AT III, близка к оптической плотности в контроле, где вместо фукоидана вносили буферный раствор. Близкие к контролю значения оптической плотности были обнаружены в смеси тромбина, хромогенного субстрата и гепарина. Т.е., показатели поглощения в пробах под влиянием фукоидана и гепарина являются сопоставимыми. Это свидетельствует об отсутствии самостоятельного (без AT III) антикоагулянтного действия фукоидана. Снижение оптической плотности (в сравнении с контролем) смеси фукоидана в концентрациях 100 или 1000 мкг/мл, тромбина, хромогенного субстрата и AT III было сопоставимым с таким же снижением в смеси гепарина, тромбина, хромогенного субстрата и AT III, различия между этими показателями не являются статистически значимыми (р>0,05). Очевидно, что это снижение обусловлено инактивацией тромбина антикоагулянтом (фукоиданом либо гепарином) в присутствии AT III.

---

При исследовании антикоагулянтной активности фукоиданов invivoустановлено, что однократное внутрибрюшинное введение фукоидана I

139

в дозе 5 мг/кг мышам линии BALB/c приводило к гипокоагуляции, о чем свидетельствует увеличение времени свертывания в АПТВ-тесте в 3,3 раза (р>0,05) и в тромбо-тесте — в 4,0 раза (р>0,05) через 15 мин после инъекции (табл. 1). По истечении 30 мин время свертывания в этих тестах отличалось от контрольного в 1,8 и 1,6 раза, а через 60 мин показатели коагулограммы возвращались к контрольному уровню. При введении мышам фукоидана II в такой же дозе время свертывания плазмы через 15 мин после введения увеличивалось по сравнению с контролем в 4,1 раза в АПТВ-тесте (р<0,05) и в 5,3 раза в тромбо-тесте (р<0,05); через 30 мин после инъекции препарата время свертывания возрастало в 2,9 и 2,1 раза (р<0,05) соответственно. К контрольному уровню время свертывания возвращалось только через 180 мин, т.е. антикоагулянтный эффект фукоидана II был более продолжителен по сравнению с фукоиданом I (табл. 6.1).

При увеличении кратности введения фукоидана из F. evanescensживотным до 10 (ежедневное внутрибрюшинное введение в течение 10 суток) отмечен более выраженный процесс гипокоагуляции с замедлением по сравнению с контролем времени свертывания в АПТВ-тесте в 3,6 раза, в ПВ-тесте в 3,3 раза, в ТВ-тесте в 7,1 раза (р<0,05) (табл. 2).

В связи с тем, что фукоиданы перспективны для разработки новых БАД к пище и лекарственных препаратов, важным является исследование антикоагулянтной активности фукоиданов при условии их введения per os. В этом случае доза фукоидана составила 50 мг/кг.

При 10-кратном пероральном введении фукоидана показатели гемостаза не отличались статистически значимо от таковых в контроле. При увеличении продолжительности перорального введения фукоидана животным до 30 дней наблюдалось пролонгирование времени свертывания в 1,4-1,5 раза по сравнению с контролем (р<0,05) (табл. 2).

Таким образом, фукоидан из F. evanescensоказывает антикоагулянтный эффект при парентеральном и длительном (30-кратном) пероральном введении животным. С увеличением кратности введения фукоидана развивается более глубокая гипокоагуляция.

140

Таблица 6.1 Показатели гемостаза при внутрибрюшинном введении фукоиданов,выделенных из F. evanescens(I) и S. cichorioid.es(II),

---

мышам BALB/c

Время после введения (мин)	Время свертывания плазмы крови (сек)
	АПТВ					ТВ
	I	ИС	II	ИС	I		ИС	II	ИС
15 ркК pI-II	150±20* <0,05 >0,05	3,3	180±8* <0,05	4,0	70±10,7* <0,05 >0,05		4,1	90±14* <0,05	5,3
30 ркК pI-II	90+11 >0,05 >0,05	1,8	130+11* <0,05	2,9	28±3,4 >0,05 >0,05		1,6	35±2,7* <0,05	2,1
60 ркК pI-II	47±0,9 >0,05 >0,05	1,0	75±9,7 >0,05	1,6	17±0,8 >0,05 >0,05		1,0	20±1,6 >0,05	1,2
180 ркК pI-II	45±1,6 >0,05 >0,05	0,99	44±1,4	0,96	17,0±0,9 >0,05 >0,05		1,0	17±0,8	1,0
Контроль(К)	45,5±1,1					17,0±0,5

Примечание: показатели гемостаза Ме±т; ИС — индекс стимуляции — рассчитан как отношение времени свертывания в опыте и контроле; р-значимость различий показателей в опыте по сравнению с контролем (К); использован непараметрический Q-критерий Данна; при сравнении показателей I и II использован непараметрический z-критерий Манна-Уитни; п=5; (*р<0,05) — различия статистически значимы по отношению к контролю.

---

Таблица 6.2 Влияние фукоидана из F. evanescensна систему гемостаза у мышей

BALB/c в зависимости от кратности и способа введения

Показатель гемостаза (М±т)	Группа животных
	Контроль	Фукоидан 1-кратно в/б	ИС	Фукоидан 10-кратно в/б	ИС	Фукоидан 10-кратно п/о	ИС	Фукоидан 30-кратно п/о	ИС
АПТВ (сек.) Р	45,0±1,2	82,0±3,6*	1,8	163,0±4,8*	3,6	52,0±2,6	1,2	62,0±2,6*	1,4
		<0,05		<0,05		>0,05		<0,05
ПВ (сек.) Р	17,0±0,8	21,0±1,1*	1,2	56,0±2,0*	3,3	20,0±1,4	1,2	25,0±1,1*	1,5
		<0,05		<0,05		>0,05		<0,05

141

ТВ (сек.) Р	19,0±0,7	32,0±1,6*	1,7	135±4,0*	7,1	23,0±1,3	1,2	26,0±1,0*	1,4
		<0,05		<0,05		>0,05		<0,05

---