Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

вспомогательный метод в медицине при диагностике и лечении некоторых заболеваний. О возможностях метода и границах его применимости можно судить по обзорным работам [14—34].

1.1.1.Применение в биохимии

Ионообменная хроматография на колонках применяется в трех очень важных областях: 1) для качественного и количе­ ственного аминокислотного анализа пептидов и белков, даю­ щего ценную характеристику молекул; его можно использовать как средство обнаружения некоторых специфических различий среди белков; 2) для определения аминокислотного состава био­ логических жидкостей, который дает не только существенную информацию о наличии свободных аминокислот, но и позволяет проследить за изменениями, происходящими в организме под воздействием многих факторов, таких, как окружающая среда, физиологическое состояние и генетическая конституция; 3) для определения первичной структуры белков — чрезвычайно важ­ ной задачи биохимии сегодняшнего дня. Многие исследователи занимаются определением аминокислотной последовательности большого числа разнообразных белков. Это дает возможность установить их химическую структуру и изучить ее взаимосвязь с функцией.

Известно большое число методик, пригодных для точного количественного анализа аминокислот и пептидов (см. разд. 1.3). Обычно белки или пептиды гидролизуют до составляющих их аминокислот обработкой кислотой или щелочью; при анализе биологических жидкостей белки предварительно отделяют.

Для определения аминокислотной последовательности при­ меняют частичный гидролиз, используя ферменты (такие, как пепсин, трипсин, химотрипсин) или химические реагенты, доста­ точно специфичные по их расщепляющей способности. Однако анализ таких гидролизатов дает неполную информацию относи­ тельно последовательности аминокислот. Дополнительная ин­ формация может быть получена путем анализа С- и N-концевых аминокислот. Большая часть последовательности может быть установлена путем получения различной величины пептидов с «перекрывающимися» аминокислотными остатками при исполь­ зовании целого ряда ферментативных и химических методов.

По одной из методик, предложенных Эдманом [35], N-конце- - вую аминокислоту сочетают с фенилизотиоцианатом и отщепляют от пептида с помощью безводной кислоты в виде тиазолинона. Концевую аминокислоту идентифицируют либо субстрактивным методом, по которому остаточный пептид, отбирают, гидролизуют и анализируют с помощью хроматографии, либо превращением тиазолинона в ФТГ (фенилтиогидантоин)-произ-

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НА СФЕРИЧЕСКИХ СМОЛАХ

водное, которое' может быть индентифицировано хроматографи­ чески. После отщепления остаточный пептид имеет новую N -koh- цевую аминокислоту, которую можно идентифицировать выше­ описанным способом, используя такой же прием.

Ряд интересных применений таких методик описан Смитом [36], Бенисеком [37] и другими авторами [38—41].

1.1.2.Применение в медицине *

Выявление и массовое обследование метаболических нару­ шений,' которые поддаются лечению, имеют решающее значение для терапии некоторых психических заболеваний. Многим мето­ дам обследования, которые используются для обнаружения от­ клонений, связанных с нарушением метаболизма аминокислот, недостает надлежащей специфичности и чувствительности для определения количества участвующих аминокислот. Несмотря на то что обычный и ускоренный методы ионообменной хрома­ тографии обеспечивают необходимые чувствительность, точность и разделение, эти стандартные методы слишком длительны, для того чтобы их можно было использовать для обследования или химического анализа во время лечения.

Работа по обнаружению и лечению фенилкетонурии (ФКУ) побудила исследователей-биохимиков к поиску других врожден­ ных болезней, в основе которых лежит нарушение метаболизма аминокислот и которые выражаются в умственной отсталости и других дефектах развития. Берлоу [42] сообщил на основании биохимических анализов мочи больного ребенка, что «ложная положительная» реакция на феррихлоридный тест указывает на повышенный уровень фенилпировиноградной кислоты, связаный обычно с ФКУ. Впоследствии было установлено, что этот ребе­ нок страдал от гистидинемии. Гхадими [43] и Ля Ду [44] при­ вели другие случаи нарушения метаболизма гистидина. Не­ смотря на то что известно лишь о нескольких случаях цистатионинурии, предполагаются последующие публикации [45]: с одной стороны, благодаря усовершенствованиям хроматографической техники, которая позволит анализировать отдельные аминокис­ лоты, и, с другой стороны, благодаря многоплановым обследо­ ваниям, проводимым на таких объектах, как сыворотка и моча. При гомоцистинурии, по сообщению Перри [46], найден повы­ шенный уровень содержания метионина и гомоцистина в крови и гомоцистина в моче [47]. Приведены методики [48—50] обнару­ жения аминокислот, играющих важную роль при лейцинозах **.

*См. также обзорные работы [41а, 41Ь].

**Заболевание, связанное с нарушением метаболизма аминокислот с раз­ ветвленными боковыми цепочками (валин, лейцин, изолейции). — Прим, перев.

12 ГЛАВА I

Метод обнаружения в больничных условиях фенилкетонурии у новорожденных младенцев был описан Гутри [51]. При врож­ денной фенилкетонурии наблюдается недостаточное количество фермента, который превращает путем гидроксилирования фе­ нилаланин в тирозин. Сакс [52] сообщил об изучении метабо­ лизма фенилаланина, сравнивая «нормальных» душевнобольных пациентов и фенилкетонуроников. Дополнительные сообщения исследовательского характера включают аспекты аминокислот­ ного метаболизма при ФКУ и других аминоацидопатиях [53], химические и метаболические исследования фенилаланина у олигофренов [54] и лечение злокачественных заболеваний путем ограничения содержания фенилаланина [55].

Другими нарушениями аминокислотного метаболизма, пред­ ставляющими интерес, являются цистинурия, описанная Стейном [3], Дентом [56], Розенбергом [57] и Кроухоллом [58], болезнь Вильсона, описанная Беллом и сотр. [59], гиперпролинемия [69], гиперглицинемия и гиперглицинурия [61].

Для другой области клинических исследований представляет интерес сообщение Зальцера и Балиса [62] об аминокислотах, которые входят в состав дезоксирибонуклеопротеидов (ДНИ) опухолей. Установлено, что ДНП опухолей содержат меньше основных аминокислот, чем ДНП нормальных тканей, и что в некоторых небольших опухолях присутствует также вещество, хроматографически подобное ароматическим аминокислотам.

Проведены исследования по определению содержания амино­ кислот в сыворотке крови больных инфарктом миокарда и дру­ гими сосудистыми заболеваниями [63]. Найдены значительные изменения в содержании некоторых аминокислот в сыворотке крови больных с поражениями миокарда.

Содержание свободных аминокислот при раке молочной же­ лезы было изучено Райяном [64]; в опухолях были найдены гомоцитруллин и два неидентифицированных пептида.

Описано влияние витамина В6 на аминокислоты у пациентов, страдающих детской пеллагрой (Квашиоркор) [65]. В моче больных, страдающих псориазом, определено 27 аминокислот и других нингидрин-положительных соединений [66]. Выделение аминокислот во время беременности исследовали Армстронг и Яте [67]; они установили, что количество треонина было увели­ чено в три раза, количество выделявшегося таурина увеличива­ лось ёжедневно вплоть до восьми недель, а уровень содержания мочевины и этаноламина оставался без изменений. Позднее Браун [68] опубликовал данные по изучению аминоацидурий. Повышенное содержание цистина, орнитина, аргинина и лизина наблюдали тогда, когда раковым больным прописывали цикло­ лейцин. Определялся почечный клиренс свободных аминокислот у подростков с помощью ускоренного метода хроматографии