Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

основных аминокислот [69]. Сообщалось [70] о выделении фосфоэтаноламина, выявленном при многостороннем анализе экскре­ ций аминокислот [71], и о его связи с гипофосфатазией у взрос­ лых и детей.

Соответственно с накоплением знаний о метаболизме амино- . кислот для нужд клинического анализа появляется необходи­ мость не только в увеличении скорости хроматографического анализа, но и в накоплении количественных данных о содержа­ нии аминокислот в цереброспинальной жидкости человека [72], свободных аминокислот в спинномозговой жидкости [73], сво­ бодных аминокислот в крови и моче [6, 74, 75] и свободных ами­ нокислот в плазме крови новорожденных [76].

Об изучении (3-аланинурии у больных туберкулезом [77] и

важности усвоения аминокислот в кишечнике сообщили Агар и сотр. [78].

Несколькими исследователями разработаны ускоренные ме­ тоды хроматографического анализа аминокислот не только для обнаружения многих врожденных дефектов метаболизма, о ко­ торых упоминалось выше, но и для быстрого анализа многих аминокислот физиологических жидкостей. Так, Льюис [79] ис­ пользовал. короткую ионообменную колонку для определения метионина и цистина. Для разделения при комнатной темпера­ туре была использована колонка размером 40X1.5 см, запол­ ненная смолрй зеокарб-225 (>200 меш); пробу предварительно окисляли. Прй скорости течения буферного раствора 200 мл/ч цистеиновая кислота элюируется при объеме элюата 36—40 мл,

еСреднее из трех анализов плазмы крови мужчин и пяти анализов плазмы крови женщин (см. [76]).

жОдин анализ.

18 ГЛАВА I

а метионинсульфон — при объеме ПО—120 мл. На основе по­ лученных данных рассчитываются количества цистина и метио­ нина.

Ших [80] описал процедуру быстрого анализа аминокислот на короткой колонке. Группа его сотрудников привела способ разделения на короткой колонке некоторых аминокислот, необ­ ходимых для диагностирования и контроля заболеваний, связан­ ных с аминокислотным метаболизмом. Была использована ко­ лонка размером 20 X 0.9 см при скорости течения буфера 60 мл/ч. Все анализы завершались менее чем за 2,5 ч.

Бенсон [81] описал ускоренную хроматографию аминокислот, связанных с фенилкетонурней, лейцинозом и другими врожден­ ными дефектами метаболизма. Эти анализы выполнены на од­ ной колонке, заполненной сферической катионообменной смолой типа РА-35, которая может быть также использована для хро­ матографического разделения основных аминокислот, присут­ ствующих в физиологических жидкостях.

Среди более чем 200 известных видов нарушений обмена веществ имеется много областей для использования хромато­ графического анализа с целью выяснения связи между функ­ циями аминокислот и болезнями человека. В таблицах 1а и 16 приведены имеющиеся данные.

1.2.ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ'--

1.2.1.Одноколоночные методы

Впроцессе разделения содержащих аминокислоты проб наи­ меньшее сродство к катионообменной смоле проявляют кислые и оксиаминокислоты. Нейтральные аминокислоты связываются

сильнее, а ароматические аминокислоты, в сравнении с ней­ тральными, имеют еще большее сродство к смоле. Самым боль­ шим сродством к смоле обладают основные аминокислоты.

По методу Пье и Морриса [82] все аминокислоты (кислые, нейтральные и основные) определяются на одной колонке за один цикл анализа с помощью градиентного элюирования. При использовании техники градиентного элюирования отпадает ста­ дия регенерации колонки, необходимая при двухколоночном ме­ тоде анализа, поскольку все аминокислоты элюируются из ко­ лонки *. Кроме того, при таком способе анализа не требуются соленоидные клапаны для переключения буферов и отпадает не­ обходимость в некоторых других деталях анализатора (напри­ мер, в насосах).

* Это справедливо только при абсолютной уверенности в том, что проба не содержит других сильно сорбирующихся пептидов или других нингидринположительных соединений, способных исказить картину последующих ана­ лизов. — Прим, перев.

для анализа используется только одна проба. Основные недо­ статки одиоколоночного метода связаны с необходимостью при­ готовления градиентных растворов и последующей очистки гра­ диентного устройства, с необходимостью удаления примесного аммиака, а также с постоянным изменением уровня фоновой линии в ходе анализа.

Позднее Миллер [83] описал ускоренный одноколоночный метод анализа, устраняющий такое изменение фоновой линии. Для этого в стартовый буфер добавляют цистеиновую кислоту (8,3 мкмоль/л), не анализируемую по этому методу, которая повышает фоновую линию в начале анализа до уровня, равного высоте фоновой линии в конце анализа. Одноколоночный метод анализа с использованием градиентного элюирования с добав­ кой 10% метанола к буферу для поддержания разделения трео­ нина и серина был описан также Томсоном и Майлсом [84]. Полностью автоматический одноколоночный метод анализа на высокоразрешающей колонке размером 125X0.636 см с исполь­ зованием последовательной дискретной смены буферов был описан Гамильтоном [85]. Высокие чувствительность и разделяю­ щая способность были достигнуты благодаря тщательному изу­ чению характеристик ионообменной смолы, конструкции ко­ лонки, кюветы и характеристик регистрирующего потенциометра.

Дас и'сотр. [86] описали’ применение простого недорогого управляемого крана для автоматического переключения четы­ рех буферов и последовательного переключения колонок. Для разделения аминокислот на колонке размером 60x0,9 см была использована скорость течения буфера 70 мл/ч.

1.2.2.Двухколоночные методы

Спакман, Стейн и Мур [12] предложили метод анализа кис­ лых и нейтральных аминокислот на колонке размером 150 X X 0,9 см при использовании двух буферов, заменяемых один на другой в середине анализа. Согласно их методу, основные ами­ нокислоты анализируются на второй колонке с использованием третьего буфера более высокой ионной силы и pH. Для анализа основных аминокислот, обычно встречающихся в пептидных и белковых гидролизатах, применяется колонка размером 15 X X 0.9 см. По этой методике для каждой колонки требуется от­ дельная проба; однако методика имеет большие возможности. Так, если необходимы сведения только о нескольких основных аминокислотах, например, в случае анализа физиологических жидкостей, то они могут быть получены без предварительного элюирования кислых и нейтральных аминокислот, которые при одноколоночном методе элюируются в первую очередь.

Имеется вторая схема анализа, которая обеспечивает луч­ шее разделение аминокислот при анализе физиологических жид­ костей и дает возможность анализировать большее число ами­ нокислот. Для анализа кислых и нейтральных аминокислот ис­ пользуют ту же самую колонку размером 150X0,9 см; однако анализ основных аминокислот проводят на колонке 50 X 0,9 см

(см. разд. 1.3).

1.2.3.Смолы

Ионообменная смола, обычно используемая для хроматогра­ фического разделения аминокислот, пептидов и несложных род­ ственных им соединений, содержащихся в физиологических жидкостях, представляет собой сополимер стирола и дивинилбензола в виде шариков. Смола, как правило, характеризуется процентным содержанием дивинилбензола или степенью попе­ речной сшивки, образующей трехмерную ароматическую сетку необработанного полимера. Для получения катионоили анионо­ обменной смолы в этот продукт необходимо ввести дополнитель­ ные функциональные группы. Для получения сильнокислотного катионита проводят сульфирование избытком серной или хлорсульфоновой кислоты в присутствии катализатора; при этом на каждые десять ароматических колец вводится 8—10 сульфогрупп. Путем хлорметилирования (хлорметиловый эфир) гранул необработанного полимера в присутствии катализатора с после­ дующей обработкой третичным амином (триметиламин) полу­ чают сильноосновный анионит, имеющий четвертичные атомы азота. При введении функциональных групп в полимер чрезвы­ чайно важно контролировать побочные реакции. Можно ввести сульфоновые поперечные мостики в сильнокислотный катионит и получить более сильно сшитый продукт. Повышенное сшива­ ние можно наблюдать при синтезе анионитов в том случае, когда хлор хлорметильной группы одного кольца и водород со­ седнего кольца сближены [87]. Поэтому важно, чтобы процесс полимеризации и введение функциональных групп тщательно контролировались на хроматографическую воспроизводимость. Как указывалось выше, функциональной группой катионообмен­ ных смол является — SC^Na (когда используются натрийцит-

ратные буферы), а анионообменных смол—группа—ОДСНз^ОН'.

Продажные смолы выпускаются для применения в водных средах; дауэкс, амберлит, пермутит, аминекс (дауэкс) и дуолит изготовляются с размером зерна 20—50 меш *.

* Производители: «Dow Chemical Company», Мидленд, Мичиган (дауэкс)) «Rohm and Haas Company», Филадельфия, Пенсильвания (амберлит): «BioRad Laboratories», (распространитель смол дауэкс), Ричмонд, Калифорния

(аминекс); «Chemical Process Company», Редвуд-Сити, Калифорния (дуолит).