Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

Ранние исследования по хроматографии аминокислот и пеп­ тидов показали, что для сокращения продолжительности ана­ лиза необходимы смолы с малым размером зерна, поскольку в этом случае быстрее достигается состояние равновесия между аминокислотами и окружающим раствором. (Трудности с полу­ чением воспроизводимых результатов от партии к партии встре­ чаются даже при использовании смол с размером зерна менее 400 меш.) Размалыванием такого сферического полимера полу­ чают мельчайшие порошкообразные частицы, улучшающие раз­ деление и позволяющие ускорить анализ. Однако выход целе­ вого продукта чрезвычайно мал и, кроме того, требуется очистка смолы от примесей. Сферические смолы, полученные специфиче­ скими методами из мономеров, позволяют еще в большей сте­ пени сократить время анализа и улучшить разделение [88].

Аминокислоты представляют собой органические соединения, содержащие по меньшей мере одну карбоксильную (кислую) группу и одну аминогруппу (основную), находящуюся в а-поло- жении по отношению к карбоксильной группе. Когда аминокис­ лота хроматографируется на колонке с катионообменником

(—SO;jNa+), который предварительно уравновешен буферным раствором цитрата натрия, то молекула аминокислоты (в кислом растворе) притягивается ионными силами к сульфогруппе смолы своей положительно заряженной аминогруппой. Таким образом, при различных значениях pH аминокислоты находятся в различ­ ных состояниях [89—90]:

Отношение количества аминокислоты, связанного с ионообменником, к ее количеству, оставшемуся в растворе, выражается коэффициентом распределения (К) данной аминокислоты. Этот коэффициент распределения помогает разделять различные ами­ нокислоты и зависит от боковых радикалов (R) аминокислот. Аминокислота с самым низким коэффициентом распределения продвигается вниз по колонке в токе буфера до тех пор, пока не придет в контакт со смолой, которая менее насыщена этой ами­ нокислотой; здесь она адсорбируется и устанавливается новый коэффициент распределения. Затем повой порцией буфера, не содержащей каких-либо аминокислот, освобождается аминокис­ лота со следующим, более низким, коэффициентом распределе­ ния, которая уносится вниз по колонке, пока вновь не установится

22 ГЛАВА 1

равновесие со смолой. Тот факт, что имеются различные коэффи­ циенты распределения, означает, что каждая аминокислота ми­ грирует вниз по колонке с различной скоростью.

Факторы, влияющие на разделение аминокислот, описаны в разд. 1.4. В некоторых случаях анионная форма смолы дает определенные преимущества, которые помогают в разделении аминокислот и пептидов благодаря их способности образовывать более прочные связи за счет ионизированных карбоксильных групп. Партридж [91] использовал анионообменную смолу для хроматографии аминокислот; в этих условиях аминокислоты и пептиды, несущие наименьший отрицательный заряд, связы­ ваются смолой в щелочной среде чрезвычайно слабо. Анионооб­ менные смолы нашли также применение для разделения ней­ тральных сахаров в виде боратных комплексов (Оме [92], Грин [93]); было также достигнуто разделение на одной анионообмен­ ной колонке смеси оснований, нуклеозидов и нуклеотидов [94].

Прежде чем тот или иной метод анионообменной хромато­ графии получит широкое применение, должен быть рассмотрен ряд вопросов, таких, как стабильность функциональных групп смолы, поперечное сшивание смолы или стабильность матрицы полимера, воспроизводимость партий смолы. Потеря стабиль­ ности активного участка влияет на результаты хроматографи­ ческого разделения двояким образом: во-первых, уменьшение числа теоретических тарелок ионообменной колонки [95] приво­ дит к изменению последовательности элюирования хроматогра­ фируемых зон; во-вторых, продукты разложения смолы являются во многих случаях нингидрин-положительными, что приводит к нестабильной фоновой линии (так называемые химические по­ мехи). Воспроизводимость смолы от партии к партии необхо­ дима для того, чтобы каждый разработанный и опубликованный хроматографический метод мог быть повторен без лишних уси­ лий, а не стал достоянием отдельных исследователей.

1.2.4.Хроматографические колонки

Обычно для хроматографических колонок используют калиб­ рованные толстостенные трубки из боросиликатного стекла. Ка­ либрованная изнутри стеклянная трубка необходима по следую­ щим причинам: а) при постоянной линейной скорости элюента предотвращается перемешивание зон аминокислот; б) опреде­ ленная спецификация позволяет изготавливать внутренние уп­ лотнения и другие детали колонки, например уплотняющие фитинги на концах колонки и фильтры для удержания смолы. Толстостенное стекло предотвращает поломки при рабочем дав­ лении, составляющем обычно 14—42 атм. Однако если тол­ щина стенок колонки слишком велика, то это может неблаго­

приятно сказываться на получении желаемого температурного градиента при смене температуры. Немаловажным является и состав стекла, который может создавать дополнительные труд­ ности в работе: а) повышение рабочего давления в результате взаимодействия стекла со смолой; б) нарушение разделения проб с небольшим содержанием аминокислот [96—97] вслед­ ствие так называемого «пристеночного эффекта» или связыва­ ния пробы со стенками стеклянной трубки. Что касается мето­ дов производства стекла, то его состав в настоящее время за­ висит от различных эмпирических факторов. Но поскольку из-за увеличения скорости буфера и сокращения времени анализа давление приближается к максимальному пределу, то нежела­ тельные эффекты, отмеченные при более низких рабочих давле­ ниях, не проявляются. В соответствии с вышеизложенным, для того чтобы уменьшить «пристеночный эффект», в современных методах используются преимущественно колонки диаметром 0,9 см, а не колонки с меньшим внутренним диаметром.

Калиброванные стеклянные трубки изготавливаются путем усадки некалиброванных трубок-заготовок вокруг калиброван­ ного стержня под действием нагревания и вакуума. Качество калиброванной трубки зависит от качества заготовки. Для изго­ товления колонок используют боросиликатное стекло, которое обладает достаточной химической стойкостью и которое благо­ даря низкому коэффициенту термического расширения устой­ чиво к резким изменениям температур. Для того чтобы указан­ ные свойства проявлялись в наибольшей степени, необходимо высокое содержание двуокиси кремния в сырье. Вследствие мно­ гих неконтролируемых процессов при производстве стеклянных колонок (незначительные изменения в составе сырья от партии к партии, а также в составе сырья, закупаемого у различных поставщиков) внутренняя поверхность колонок получается не­ одинаковой, что сказывается на взаимодействии смолы со стек­ лом.

1.2.5.Элюирующие жидкости

Для понимания функции буферов, используемых в хромато­ графии аминокислот, важно понять, что, по мере того как ами­ нокислоты, находящиеся в растворе на верху колонки, мигри­ руют вниз по смоле, на каждой теоретической тарелке или в каждой зоне колонки устанавливается равновесие. Разделение аминокислот, содержащихся в пробе, зависит от многих контро­ лируемых факторов, таких, как размер зерна ионообменной смолы, ее химическая природа и степень поперечной сшивки, диаметр колонки и высота столбика смолы, температура ко­ лонки, заряд и величина боковой цепочки аминокислоты, а

24 ГЛАВА 1

также ионная сила, величина pH и скорость течения элюирую­ щего буфера.

Скорость элюирования аминокислот и пептидов в значитель­ ной степени определяется составом и величиной pH буферов. Стейн и Мур [1] сообщили об использовании соляной кислоты увеличивающейся нормальности для элюирования аминокислот из колонки, заполненной смолой типа дауэкс-50 (сильнокислот­ ный сульфокатионит). В дальнейшем они установили, что бу­ ферные растворы цитрата и ацетата натрия имеют определен­ ные преимущества, поскольку при их использовании меньше раз­ рушаются и теряются лабильные аминокислоты, легче осущест­ вляется анализ вытекающего из колонки эффлюента с помощью нингидриновой реакции. Они показали также, что свойства элюента можно изменять добавлением органических раствори­ телей. Так, при добавлении к буферным растворам бензилового спирта в количестве 1 % пики ароматических аминокислот ста­ новятся более острыми. Пропиловый спирт ускоряет элюирова­ ние преимущественно таких аминокислот, которые имеют боль­ шие неполярные боковые цепочки [2].

Применение буферных растворов в жидкостной хроматогра­ фии на колонках требует рассмотрения ряда аспектов, которые обычно не обсуждаются при использовании буферов для других целей: а) чистота реагентов; б) молярная концентрация солей, включая соли, необходимые для получения буферной емкости; в) растворы, не содержащие газов; г) растворы, не содержащие плесневых грибов и спор; д) растворы, не содержащие коллои­ дов и пыли; е) определение Н-ионов с минимальным влиянием активности других катионов.

Поскольку через ионообменную смолу в колонке в течение длительного времени пропускается относительно большой объем буферных растворов, то на смоле адсорбируются некоторые ка­ тионы металлов, которые не элюируются при обычной процедуре регенерации смолы. Это приводит к постепенному уменьшению обменной емкости смолы. Однако первоначальная емкость смолы может быть восстановлена по специально предписанной мето­ дике. При хроматографии на анионообменных смолах некоторые комплексы металлов, обнаруживаемые в следовых количествах в-буферных растворах необратимо реагируют со смолой. Перво­ начальная емкость такого анионообменника не восстанавли­

вается.

Обычно при применении буферных растворов точная моляр­ ная концентрация солей не имеет решающего значения. Однако при элюировании аминокислот и пептидов из колонки, адсорби­ рующей катионы, очень важна концентрация катиона (кро­ ме Н+), поэтому требуется тщательная проверка концентрации катиона в буферных растворах. Важно также знать тип и кон­