Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

Таблица 3

ЧИСЛО АМИНОГРУПП РАЗЛИЧНЫХ БЕЛ КОВ,-МОДИФИЦИРУЕМЫХ НХС (НХДС), ХФБ И ТНБС [100, 102, 1031

nt — общее число аминогрупп.

пени, как и НХС; модифицированные белки в этом случае бо­ лее устойчивы [101]. При модификации лизина НХДС-4,6 и НХДС-4,7 Дб48о составляет соответственно 7180 и 6500 М-1см-1. При расчете п используют V2 от этих величин. Нафтохинон-4,5- дисульфокислота не взаимодействует с аминогруппами белков.

9.3.4.2.Монохлортрифтор-п-бензохинон (ХФБ)

Монохлортрифтор-/г-бензохинон [102], порошкообразное ве­ щество желтого цвета, оно устойчиво в диоксане, но медленно гидролизуется в водных растворах. В дифференциальных спек­ трах продуктов реакции с аминокислотами имеется максимум при 350 нм (у глицина Дез5о=16 600 М-1 см-1, у лизина Дез5о= = 35200М-1 см-1). Дифференциальный спектр продуктов взаи­ модействия с белками имеет максимум при 353 нм, Дезбз в этом случае несколько выше. Для расчета п можно использовать Де353 = 21 600 М-1 см-1 бацитрацина, содержащего одну амино­ группу. ХФБ несколько менее реакционноспособен по сравне­ нию с НХС, НХДС и ТНБС (см. табл. 3) [100, 102, 103].

9.3.4.3.2,4,6-Тринитробензолсульфокислота (ТНБС)

Этот реагент, предложенный Окияма и Сатаке [104], также арилирует аминогруппы в*белках с отщеплением сульфогруппы. После инкубации при pH 9 в реакционную смесь добавляют '/з часть диоксана [103], а затем фотометрируют при 425 нм в срав­ нении с контрольным раствором. Диоксан тормозит постепенное

и практически бесконечное возрастание поглощения, обуслов­ ленное, по-видимому, сорбцией ТНБС на белке и (или) агрега­ цией модифицированного белка. Де определяют в тех же усло­ виях. Величины, полученные для аланина, взятого в качестве стандарта, варьируют в пределах 15 000—20 000 М-1 см-1.

При обработке трипсина НХДС, ХФБ и ТНБС модификация идет соответственно по 13, 4 и 14 аминогруппам (из 15), оста­ точная ферментативная активность составляет 50, 20 и 5% соот­ ветственно [103]. При аналогичной обработке а-химотрипсина (см. табл. 3) реакция идет по 13—14, 10 и 12 аминогруппам со­ ответственно, а остаточная активность составляет 60, 5 и 0%. Тономура [105, 106] определял аминокислотную последователь­ ность фрагментов G-актина, содержащих остатки лизина, моди­ фицированного ТНБС. Эти же авторы показали, что миозин присоединяет 2 моля ТНБС [107, 108], а также определили строение ТНФ-(тринитрофенил)-содержащих пептидов. По дан­ ным Такемори в цитохроме с модификация ТНБС идет по Lys72 и Lys 73 [109]. Модификация ТНБС одной или двух амино­ групп полностью инактивирует ингибиторы трипсина [ПО].

9.3.4.4.Метилизомочевина

При взаимодействии О-метилизомочевины или S-метилизо- тиомочевины с е-аминогруппой лизина образуется гуанидиновая группировка [111, 112]

эта реакция была использована Хаге с сотр. [113] для модифи­ кации О-метилизомочевиной сывороточного альбумина. Авторы

вращаются 54—55 из 68 аминогрупп. Затем этот реагент приме­ няли для модификации многих белков: казеина, гемоглобина, лизоцима и альбумина [114], химотрипсиногена [115, 116], рибонуклеазы [117, 118], пептидных гормонов [117], инсулина [119], цитохрома с [120] и ингибитора трипсина [121]. Реакция идет довольно избирательно, например, в инсулине удается полно­ стью перевести в гуанидиновое производное Lys В29, тогда как N-концевые GlyAl и PheBl модифицируются соответственно на V2 и 7ю [119]. Модификация 9 из ГО е-аминогрупп рибонуклеазы не инактивирует фермент, но модификация по крайней мере одной е-аминогруппы активного центра приводит к полному па­ дению активности [119]. S-Метилизотиомочевина менее реак-

циониоепособна по сравнению с О-метилизомочевиной [114]. Маекава и Линер [122, 123] показали, что при обработке трип­ сина S-метилгликозилизотиомочевиной на холоду (0°С) при pH 8,8 в течение 3 дней модификация идет по трем остаткам лизина и гистидина.

9.3.4.5.Янтарный ангидрид

С помощью янтарного ангидрида в белки вводят (через ами­ ногруппы) сукцинильную группировку, вследствие чего молекула приобретает более отрицательный заряд. Сузуки с сотр. показал [124—126], что при такой обработке наблюдается активация бактериальной амилазы. Кроме того, для введения в така-ами­ лазу карбоксила и сульфгидрильных групп эти авторы исполь­ зовали S-ацетилмеркаптоянтарный ангидрид с последующей об­ работкой гидроксиламином.

9.3.4.6.Изоцианат и изотиоцианат

Для модификации свободных аминогрупп применяются фенилизоцианат и фенилизотиоцианат [127, 128]. В последнее время для этой цели предпочитают использовать флуоресцеинизотиоцианат (ФТЦ), что объясняется более легкой индентификацией модифицированной аминогруппы. По реакционноспособности с (ФТЦ) аминогруппы инсулина располагаются в следую­ щем порядке: Phe В1 > Gly А1 >> Lys В29 [129, 130], что находится в соответствии с данными по модификации НХС, НХДС и ХФБ.

9.3.4.7.Прочие реагенты

Для модификации аминогрупп могут применяться реагент Сэнджера [131—133], 1-фтор-2,4-динитробензол и другие алкили­ рующие агенты, например моноиодуксусная кислота, ее эфир и амид. Помимо аминогрупп, эти реагенты могут алкилировать остатки цистеина, метионина и гистидина. Однако в обычных условиях проведения реакции они обладают слишком высокой реакционной способностью и не могут применяться для частич­ ной модификации. Были сделаны попытки алкилировать рибонуклеазу бромуксусной кислотой в более мягких условиях [134— 136], при этом удалось ввести карбоксильную группировку пре­ имущественно по остаткам гистидина. Хлорангидриды и анги­ дриды кислот позволяют ацилировать аминогруппы, оксигруппы серина и тирозина, модифицировать карбоксильные группы. Однако обычно они обладают слишком высокой реакционной способностью. Имеются сведения о том [136, 137], что при