Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

VI

а второй несет реакционноспособную группировку Q—R. В ка­ честве таких реагентов для инактивации трипсина были исполь­ зованы метилгуанидин (О—А) и моноиодацетамид (Q—R). И действительно, порознь эти соединения не являются ингиби­ торами фермента; при совместном применении наблюдается инактивация трипсина. Инагами показал, что в качестве О—А- группы не может выступать бутилгуанидин, следовательно, для проявления ингибиторной активности существенное значение имеют размеры О-группировки

9.4.3.Введение негативной метки

Если остаток определенной аминокислоты маскирован или каким-либо иным образом защищен от действия реагента, можно пометить все остальные остатки этого типа, т. е. ввести «негативную» метку. Коэн и Варинга [226] обрабатывали холин­ эстеразу с помощью ДФФ в присутствии бутирилхолина, маски­ рующего активный центр. Затем модифицированный белок об­ рабатывали меченым ДФФ (32Р) в отсутствие бутирилхолина. Аналогичный метод был применен Кошландом с сотр. [227] при исследовании антител: вначале антитела к я-азобензоларсенату иодировали в присутствии гаптена, а затем в модифицирован­ ный белок вводили 13Ч.

Аминокислотные остатки активного центра фермента маски­ руют молекулами ингибитора или субстрата. Результаты моди­ фикации в присутствии и в отсутствие этих лигандов дают ин­ формацию относительно строения активного центра. При низкой концентрации перекись водорода в диоксане окисляет 5 из 7

сти [233, 234]. В последнее время свойства этих соединений обра­ зовывать поперечные связи в молекуле фермента или между фер­ ментом и синтетическим полимером стали использоваться для стабилизации ферментов и белков или их фиксации на нераство­ римом носителе [235—237]. В области химии белка большой инте­ рес представляет возможность с помощью подобных реагентов определять расстояние между двумя аминогруппами в нативном белке. Одним из первых реагентов, нашедших подобное примене­ ние, является 2,4-динитро-1,5-дифторбензол (НФБ) [238, 239].

F

N 02

При обработке белка здесь образуется 2,4-динитрофенилено- вый мостик между двумя свободными аминогруппами. Образова­ ние такого мостика между а-аминогруппой Gly А1 и е-амино- группой Lys В29 в инсулине свидетельствует о большой гибкости этих полипептидных цепей в растворе. В случае лизоцима [240] мостик замыкается между Lys 7 и Lys 41, пространственно сбли­ женных в третичной структуре [241]. Фэсолд синтезировал 2,2'-ди- карбокси-4,4'-азофенилдиизоцианат, который использовал при исследовании миоглобина кашалота [242—245]. Здесь были иден­ тифицированы 4 внутримолекулярных мостика: Lys 16—Lys 34, Lys 34—Lys 47, Lys 56—Lys 62, Lys 145—Lys 147.

Аналогичный реагент, гексаметилендиизоцианат, модифици­ рует в рибонуклеазе 2 моля лизина [246]. С помощью другого реагента /гщ'-дифтор-ж.ж'-динитродифенилсульфона (ФНФС) [247] модифицировали 20 остатков лизина и некоторые остатки тиро­ зина в бычьем сывороточном альбумине [247—250]. Херциг с сотр. [251] синтезировал водорастворимые бифункциональные реагенты, фенол-2,4-дисульфохлорид и а-нафтол-2,4-дисульфо- хлорид, и использовал их для образования мостиков между остатками лизина в лизоциме. При исследовании лизоцима ис­ пользовали также а.а'-дибромксилолсульфокислоту (БКС) [252], несущую радиоактивные метки 35S и 3Н; таким путем в лизоциме было обнаружено образование двух мостиков, Lys3—Lys 116 и Lys 96—Lys 97, что совпадает с результатами, полученными при модификации Lys 13, Lys 33 и Lys 116 фенол-2,4-дисульфохлори- дом [251]. При такой модификации аминогруппы уже не несут в нейтральной среде положительного заряда, вследствие чего тре­ тичная структура становится менее стабильной, подверженной конформационным изменениям. Учитывая это обстоятельство, Зингер с сотр. [138, 253] синтезировал дихлоргидрат диэтилма-