Файл: Кощеев, А. К. Люминесцентный анализ пищевых продуктов.pdf

раты, обладающие фосфатазной активностью, или про­ теолитические ферменты типа трипсина при соответ­ ствующей величине pH растворов.

Применимость метода. Метод применим для опреде* ления рибофлавина в пищевых продуктах, а также в жи-: вотных и растительных тканях.

Приборы

Флуорометр с чувствительным гальванометром, специ­ фичными светофильтрами и кюветами

Качалка механическая Центрифуга со стаканами на 50 и 100 мл Термостат Потенциометр Водяная баня

Посуда

Ступки фарфоровые диаметром 5—10 и 15—20 см Колбы мерные на 100, 250, 500 и 1000 мл Колбы конические на 100, 300 и 500 мл Цилиндры мерные на 25, 50, 100 и 250 мл Бюксы разных размеров Воронки диаметром 10—12 см

Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл

Реактивы и приготовление растворов

Стандартный раствор рибофлавина готовится путем растворения в дистиллированной воде 20 мг рибофлави­ на в мерной колбе на 500 мл (1 мл раствора содержит 40 мкг рибофлавина). Раствор сохраняется в течение месяца при хранении в темноте на холоде. Перед ана­ лизом приготовляют рабочий раствор, для чего 0,5— 1 мя стандартного основного раствора вносят в мерную колбу, на 100 мл и доводят водой до метки (1 мл рабочего рас­ твора содержит соответственно 0,2—0,4 мкг рибофла­ вина)

0,1 н раствор серной кислоты

Фосфатный буфер с pH 7,8—8. Приготовляют 1/15М

4%-ный раствор марганцовокислого калия. Раствор хранят не более 2 недель в посуде из темного стекла.

3%-ный раствор перекиси водорода

10 г хлористого олова SnCl растворяют в 25 мл кон­ центрированной соляной кислоты. Раствор хранят в тем­ ной склянке с притертой пробкой. Из основого раствора перед анализом приготовляют рабочий раствор, для чего 0,5 мл основного раствора разбавляют водой до 100 мл.

Гидросульфит натрня. Перед анализом приготовляют раствор, для чего 0,25 г растворяют в 10 мл 2%-ного рас­ твора двууглекислого натрия.

Ферментные препараты: трипсин или панкреатин; пре­ парат из мицелия Penicillium или очищенный энзимати­ ческий препарат Aspergillus*.

При внесении исследуемого вещества в вытяжку фер­ ментный препарат растирают в ступке с 5—10 мл буфер­ ного раствора **.

Методика исследования. 5—10 г пробы тщательно растирают в ступке с небольшим количеством фосфатно­ го буфера с pH 7,8—8. Массу переносят в колбу с добав­ лением того же буферного раствора, которым смывают несколько раз ступку, до объема приблизительно 1 :20, выдерживают на кипящей водяной бане в течение 45 ми­ нут.

После охлаждения проверяют значение pH, в случае сдвига доводят pH до 7,8—8, прибавляя 1/15М раствор одноили двузамещенной фосфорнокислой соли.

Затем в колбы со смесью вносят ферментный препа­ рат (трипсин, панкреатин, Penicillium, Aspergillus) из расчета 30 мг на 1 г исследуемого вещества, прибавляют в каждую колбу по 0,5 мл толуола. Колбы помещают в термостат при температуре 37° С на 12— 16 часов.

По истечении указанного времени колбы вынимают из термостата, pH доводят 0,1 н серной кислотой до 4,5 при использовании ферментного препарата Penicillium или до 3,5—4 при использовании препарата Aspergillus,

* Препараты могут быть применены в качестве протеолитиче­ ских ферментов. В качестве фосфатйзных ферментов можно ис­ пользовать лишь препараты Aspergillus и Penicillium (препарат Aspergillus рекомендован Научно-исследовательским институтом витаминологии Министерства здравоохранения СССР).

** В каждой новой партии ферментного препарата определить содержание рибофлавина, найденную величину вычесть из общего количества исследуемого вещества, полученного при анализе.

100

вносят растертый ферментный препарат и вновь помеща­ ют в термостат при температуре 27° С на 12—16 часовПосле инкубации колбы вынимают, охлаждают, объем доводят до общего разведения 1 : 20 или 1 :30, вытяжку фильтруют через складчатый фильтр.

Прозрачную жидкость берут на окисление посторон­ них флуоресцирующих веществ. Из фильтрата отбирают 3 пробы по 8 мл в стаканчики с притертыми пробками и в каждую из проб прибавляют по каплям 4%-ный рас­ твор марганцовокислого калия до тех пор, пока не исчез­ нет окраска, полученная после размешивания перманга­ ната. Вытяжку оставляют на 10 минут. В каждую пробу вносят по каплям для удаления избытка К.Мп04 раствор перекиси водорода до исчезновения окраски, хорошо пе­ ремешивают, добавляют по 0,2 мл рабочего раствора SnCl2 и по 0,1 мл раствора гидросульфита натрия. Ста­ каны с вытяжкой закрывают пробками и энергично встряхивают в течение 15—20 минут. После этого объем вытяжки в каждом стакане доводят водой до 10 мл и переливают в кювету флуорометра. Одновременно в дру­ гую кювету флуорометра наливают рабочий стандарт­ ный раствор и производят измерение интенсивности флуоресценции стандартного и испытуемого растворов по шкале гальванометра.

Затем во все кюветы прибавляют около 0,1 г NaHC03 и гидросульфита натрия для тушения флуорес­ ценции рибофлавина как в стандартном, так и в испы­ туемом растворе, где остается флуоресценция только по­ сторонних флуоресцирующих веществ.

Расчет содержания рибофлавина производят по фор­ муле

вещества, мкг; С — показания шкалы флуорометра для испытуемо­

го раствора;

Ci — показания шкалы флуорометра для испытуемо­ го раствора после гашения флуоресценции;

т — содержание рибофлавина в 1 мл стандартного раствора, мкг;

п— показания шкалы флуорометра для стандарт­ ного раствора;

101

Определение рибофлавина в кристаллических

препаратах

Принцип метода. Содержание витамина В2 в кристал­ лическом препарате определяется флуорометрически в связи со способностью водных растворов витамина флуо­ ресцировать.

Реактивы

Химически чистый рибофлавин (эталон)

Методика исследования. Навеску препарата (0,01 г)

переносят в мерную колбу емкостью в 250 мл, раство­ ряют в воде при легком подогревании и взбалтывании, охлаждают и доводят до метки водой. Если раствор не прозрачный — фильтруют. Из фильтрата отбирают 1 мл в мерную колбу емкостью 100 мл, доводят дистилли­ рованной водой до метки и взбалтывают.

В кювету флуорометра переносят 8— 10 мл получен­ ного раствора для измерения флуоресценции. Результат измерения сравнивают с показаниями прибора для стан­ дартного раствора (эталона), приготовленного из чисто­ го рибофлавина, как и раствор испытуемого препарата.

Содержание рибофлавина в испытуемом образце вы­ числяется по формуле

250 — первое разведение, мл;

100 — второе разведение, мл;

0,4 — концентрация стандарта, мкг/мл;

100 — коэффициент пересчета в проценты;

А— показания флуорометра для стандартного раст­ вора;

102

Определение суммарного содержания рибофлавина

Принцип метода. Суммарное содержание витамина В2 в пищевых продуктах определяется флуорометрически. Так как флавиноденинуклеотид обладает лишь 10 — 15% флуоресценции свободного рибофлавина, а прочно связанная с белком форма не флуоресцирует, рибофла­ вин должен быть переведен в свободное состояние.

Реактивы

Стандартный раствор рибофлавина. Навеску в 10 мг растворяют в воде в мерной колбе на 250 мл. В 1 мл раствора содержится 40 мкг рибофлавина. Раствор хра­ нят в темноте на холоде в течение месяца. Рабочий рас­ твор приготовляют следующим образом: в мерную кол­ бу на 100 мл вводят 1 мл стандартного раствора и до­ водят водой до метки. 1 мл рабочего раствора содержит 0,4 мкг рибофлавина.

0,1 н раствор серной кислоты

Фосфатный буфер, pH которого 7,8—8. pH готовой буферной смеси проверяют по универсальному индика­ тору

4%-ный раствор марганцовокислого калия. Хранить не более 2 недель

3%-ный раствор перекиси водорода.

Раствор хлористого олова. 10 г SnCl2 растворяют

в25 мл концентрированной соляной кислоты. Хранить

втемной склянке с притертой пробкой при комнатной температуре. Из основного раствора готовят рабочий раствор перед каждым определением путем разбавления водой 0,2 мл основного раствора (до 100 мл).

Раствор гидросульфита натра (йодсернисто-кислого натра)— Na2S 20 4-2H20. 0,25 г препарата растворяют ex tempore в 10 мл 2%-ного раствора двууглекислого натрия.

Ферментные препараты: трипсин, панкреатин, клараза или ферментный препарат из мицелия Penicillium.

103

Мицелий, отжатый от лишней влаги лабораторным прес­ сом до содержания 25—30% сухих веществ в оставшей­ ся массе, высушивают при температуре не выше 45° С, мелко растирают и хранят в сухом темном месте.

Гидросульфит натра в порошке Бикарбонат натра в порошке

Методика исследования. Навеску продукта растира­ ют в ступке с небольшим количеством фосфатного буфе­ ра (pH 7,8—8). Массу переносят в колбу при помощи буферного раствора с таким расчетом, чтобы общее разведение соответствовало отношению 1 : 15 или 1 :20. Смесь выдерживают на кипящей бане в течение 45 ми­ нут, охлаждают до температуры 30° С, проверяют значе­ ние pH и, в случае сдвига в кислую зону, доводят вели­ чину pH при помощи фосфатного буфера до 7,8—8. За­ тем добавляют к смеси ферментный препарат (трипсин или кларазу — 30 мг на 1 г сухого вещества), предвари­ тельно растерев его в ступке с небольшим количеством буфера. Смесь помещают в термостат при температуре 37° С на 12—16 часов. При этом от белка отщепляется прочно связанная с ним форма рибофлавина. pH смеси

шенный мицелий Penicillium) и снова помещают в тер­ мостат при температуре 37° С на 12—16 часов для рас­ щепления нуклеотидных форм рибофлавина.

К 10 мл фильтрата прибавляют по каплям 4%-ный раствор КМп04 для окисления посторонних флуоресци­ рующих веществ или веществ, маскирующих флуорес­ ценцию рибофлавина. Прибавление раствора КМп04 ве­ дут до тех пор, пока красноватая окраска фильтрата не стабилизируется (обычно расходуют 0,2—0,5 мл раство­ ра). Вытяжку оставляют на 10 минут и по истечении указанного времени прибавляют по каплям 3%-ный ра­ створ Н20 2 до исчезновения красной окраски раствора. После этого прибавляют к вытяжке 0,2 мл рабочего ра­ створа SnCl2 и 0,1 мл 2,5%-ного раствора гидросульфи­ та натра для восстановления посторонних флуоресциру­ ющих веществ. При этом рибофлавин переходит в лейкоформу.

Чтобы обратимо восстановленный рибофлавин вновь перешел в окисленную флуоресцирующую форму, энер­ гично встряхивают раствор в течение 20 минут (в шют-

104