Файл: Кощеев, А. К. Люминесцентный анализ пищевых продуктов.pdf

ресценции применяют ртутно-кварцевую лампу типа ПРК-2 или ПРД-4, помещенную в металлический кожух. Кожух имеет прорезь, закрытую фильтром, с максиму­ мом пропускания волн длиной 360 гщх.

Содержание тиамина определяют путем глазомерного сравнения в ультрафиолетовом свете флуоресценции опытной пробы с эталонами стандартной шкалы тиохрома.

Поскольку при флуороскопическом методе измерения проводятся визуально, необходимо изготовить не один, а целый ряд стандартных эталонов тиохрома, с которыми проводят сравнение опытных проб.

Подготовка материала к исследованию. При опреде­ лении тиамина в препаратах и пищевых продуктах подго­ товку материала к исследованию проводят так, как это описано для флуорометрического метода.

Методика исследования. Приготовление шкалы стан­ дартных растворов. Шкалу стандартных растворов при­ готовляют из основного раствора тиамина путем разве­ дения его дистиллированной водой в мерных колбах на 100 мл (табл. 13). Техника приготовления основного раствора тиамина описана на с. 81.

Из стандартных растворов -различной концентрации берут пипеткой по 1 мл и переносят в центрифужные ста­ канчики с притертыми пробками или посуду для окисле­ ния (пользоваться можно одной и той же пипеткой, если идти от слабых растворов к более концентрированным). Добавляют по 4 мл дистиллированной воды, 2 мл мети­ лового спирта.

Окисление тиамина в тиохром проводят так, как опи­ сано на с. 83, с тем различием, что в данном случае «слепой» пробы для эталонов шкалы не изготовляют.

Стандартные растворы тиохрома хранят в темном месте не более 2 дней.

Примечание. Обычно в ходе работы выясняется, что для исследуемой группы объектов можно изготовить шкалу не с 15, а с меньшим числом эталонов.

Измерение флуоресценции. После просветления изобутиловых вытяжек тиохрома из каждой пробы стан­ дартных и опытных проб отбирают по 10 мл и переносят в пробирки для измерения флуоресценции.

Интенсивность флуоресценции измеряют следующим образом: пробирки с испытуемым раствором помещают

90

Т а б л и ц а 13

Ш ка л а стандартны х растворов

в штатив, наглухо прикрепленный к кожуху аппарата пе­ ред увиолевым светофильтром, штатив устанавливают под углом в 60° и сравнивают в ультрафиолетовом свете флуоресценцию параллельных опытных проб. Если под­ метить разницу в интенсивности флуоресценции не удается, в штативе оставляют одну из проб и по обеим ее сторонам помещают эталоны стандартной шкалы, ме­ няя их до тех пор, пока не удастся подобрать равный по интенсивности флуоресценции эталон. Если флуоресцен­ ция испытуемой пробы окажется слабее одного стандарт­ ного эталона и сильнее другого, для расчетов берут сред­ нюю величину между двумя эталонами.

В том случае, если параллельные пробы с испытуе­ мым раствором различаются по интенсивности флуорес­ ценции, к каждой из них подбирают отдельные эталоны стандартной шкалы и устанавливают среднюю величину между этими измерениями.

Содержание витамина Bi в драже и таблетках рас­ считывают по формуле

где X — количество витамина B b мг%;

С— количество тиамина в 1 мл стандартного рас­ твора, флуоресценция которого совпадает с флуоресценцией испытуемого раствора, мкг;

С1— количество витамина В[ в 1 мл стандартного раствора, флуоресценция которого совпадает с флуоресценцией «слепой» пробы, мкг;

g— навеска, г;

Е— объем жидкости, в которой растворена навеска

(растворы А! и А2 ), мл;

Ei — количество растворов Ах и А2, взятых для изго­ товления растворов второго разведения (Бх и Б2), мл;

V2— конечный объем растворов В х и В 2, мл;

Ез — количество растворов Б х и Б2, взятых для окис­ ления, мл;

10 — коэффициент пересчета из микрограммов в мил­ лиграмм-проценты.

Расчет на штуку препарата драже или таблеток про­ изводится по формуле

92

где R — содержание витамина Bi в одной штуке драже таблеток, мг;

X — содержание витамина В ь мг%; g — вес штуки драже, г.

Содержание витамина Bi в объектах при анализе без адсорбционной модификации флуороскопического мето­ да рассчитывают по формуле'

у ( С - С , ) - У g - v 3- 10 *

где X — количество витамина Вь мг%;

Остальные обозначения те же, что и в формуле на с. 92.

В случае адсорбционной модификации флуороскопи­ ческого метода расчет производят по формуле

у( С - С г)-У-п

g- V3-m- 10 ’

где X — количество витамина Вь мг%;

п— объем элюата, мл;

т— объем фильтрата, взятого для адсорбции, мл.

Остальные обозначения те же, что и в формуле на с. 92.

Раздел 3. Определение витамина В2 (рибофлавина) [43]

Водные растворы витамина В2 имеют желтую окрас­ ку и обладают в ультрафиолетовом свете желто-зеленой флуоресценцией. На этих свойствах основаны методы определения рибофлавина.

Определение рибофлавина в препаратах

Принцип метода. Под действием щелочей рибофла­ вин восстанавливается и переходит в нефлуоресцирую­ щий в водном растворе лейкофлавин. Измерив на флуорометре величину флуоресценции испытуемого раствора и величину флуоресценции раствора после перевода ри­ бофлавина в лейкофлавин, определяют по разности со­ держание рибофлавина в испытуемом растворе.

Применимость метода. Метод применим для опреде­ ления рибофлавина в препаратах, не содержащих дру­ гих, кроме рибофлавина, люминесцирующих веществ.

93

Приборы

Флуорометр Весы аналитические

Весы технохимические Разновесы

Посуда

Колбы мерные на 50, 100, 500 и 1000 мл Колбы конические на 100 и 300 мл Воронки диаметром 10—15 см Ступки фарфоровые диаметром 10—15 см Бюксы разных размеров

Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл

Реактивы и приготовление растворов

Кристаллический препарат рибофлавина Стандартный раствор рибофлавина: 50 мг кристалли­

ческого препарата растворяют в мерной колбе на 1 л в горячей воде, после охлаждения доводят до метки. 1 мл раствора содержит 50 мкг рибофлавина. Раствор хранят в темноте на холоде в течение месяца. Перед анализом приготовляют рабочий раствор, для чего 0,4 мл стан­ дартного раствора вносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки водой.

Рабочий раствор содержит 0,2 мкг рибофлавина в-

30—50 штук драже и таблеток, взвешивают и опреде­ ляют вес одной штуки. Пробу тщательно растирают. На аналитических весах берут 2 навески по 1 г. Навески растворяют в горячей воде в мерной колбе емкостью 100 мл, после охлаждения доводят водой до метки. При наличии мути раствор фильтруют.

Из раствора приготовляют путем вторичного разведе­ ния рабочие растворы с таким расчетом, чтобы в 1 мл конечного раствора содержание рибофлавина было близ­ ко к содержанию его в 1 мл рабочего стандартного рас­ твора (около 0,2 мкг). Драже весом 0,25 г при содер­ жании в нем 2 мг витамина В2 0,25 мл первого раствора

94

веты помещают в темноту до определения. Одновремен­ но приготовляют раствор для «слепого» опыта к стан­ дартному и испытуемому растворам. Для этого из рабо­ чего стандартного и испытуемого растворов берут по 25 мл, добавляют в каждую колбу по 0,3 мл водного 1 н раствора едкого натра, перемешивают и отстаивают при комнатной температуре в течение 10 минут; затем рас­ творы наливают в кюветы флуорометра. Интенсивность флуоресценции стандартного и испытуемого растворов,, растворов «слепого» опыта измеряют флуорометром.

Содержание рибофлавина в испытуемом препарате* а также в одной штуке драже вычисляют по формулам;

мого раствора;

С[ — показания шкалы флуорометра для «слепого» опыта испытуемого раствора (после гашения флуоресценции);

т — содержание рибофлавина в 1 мл стандартного

,раствора, мкг;

п— показания шкалы флуорометра для стандарт­ ного раствора;

«1 — показания шкалы флуорометра для «слепого» опыта стандартного раствора (после гашения флуоресценции);

второго разведения), мл;

V2— объем раствора, взятого для приготовления ра­ бочего испытуемого раствора, мл;

g — навеска, г;

95

Р — вес штуки драже, г; 1000 — коэффициент пересчета, мг;

100 — коэффициент пересчета в проценты.

Определение рибофлавина в препаратах

с помощью флуороскопа

Принцип метода. При кипячении со щелочью рибо­ флавин в растворе разрушается необратимо, зависящая от него флуоресценция пропадает. К испытуемому рас­ твору рибофлавина после его разрушения прибавляют под контролем флуороскопа стандартный раствор рибо­ флавина до тех пор, пока интенсивность флуоресценции не достигнет концентрации исходного испытуемого рас­ твора. По количеству израсходованного при этом стан­ дартного раствора рибофлавина определяют содержание его в испытуемом растворе.

Применимость метода. Метод применим для опреде­ ления рибофлавина в препаратах, не содержащих, поми­ мо рибофлавина, люминесцирующих веществ.

(ПРК-4), помещенная в кожух с черным никелевым све­ тофильтром (стекло Вуда) и набором пробирок одина­ кового диаметра из однородного нефлуоресцирующего стекла

Весы аналитические Весы технохимические Разновесы

Посуда

Колбы мерные на 50, 100, 500 и 1000 мл Колбы конические на 100 и 300 мл Воронки диаметром 10—15 см Ступки фарфоровые диаметром 12— 15 см

Пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл Микробюретки на 2 и 5 мл

Реактивы и приготовление растворов

Рибофлавин кристаллический Стандартный раствор рибофлавина: 50 мг кристалли­

ческого препарата растворяют в мерной колбе на 1 л в горячей воде, после охлаждения доводят до метки. 1 мл

96

раствора содержит 50 мкг рибофлавина. Раствор хранят в темноте на холоде в течение месяца. Перед анализом приготовляют рабочий раствор, для чего 0,4 мл основно­

бу тщательно растиракрт, на аналитических весах берут 2 параллельные навески, около 0,5 г каждая. Навески растворяют в горячей воде в мерных колбах на 100 мл и после охлаждения раствора доводят водой до метки. При наличии мути раствор фильтруют.

Из раствора приготовляют путем вторичного разведе­ ния рабочие растворы с таким расчетом, чтобы в 1 мл конечного раствора содержание рибофлавина было близ­ ко к содержанию его в 1 мл рабочего стандартного рас­ твора (около 0,2 мкг).

Исследуя драже весом в 1 г с содержанием 2 мг ви­ тамина В2 в одной штуке, для второго разведения берут 1 мл раствора и вносят в колбу на 50 мл. Исследуя дра­ же весом 0,25 г с содержанием 2 мг витамина В2, берут 0,5 мл в колбу на 100 мл. Исследуя драже весом в 1 г с содержанием 1 мг витамина В2, берут 2 мл первого рас­ твора в колбу на 50 мл.

Из рабочих растворов наливают в пробирки флуороскопа точно по 10 мл, закрывают пробирки ватной проб­ кой и до начала определения флуоресценции защищают от яркого света.

натра, отмечают объем и, тщательно перемешав, кипя­ тят на слабом огне в течение 5 минут. После охлажде­ ния объем доводят дистиллированной водой до исходно­ го и прибавляют по 0,3 мл 1н раствора серной кислоты; pH раствора доводят до 6—6,8 (максимальная интенсив­ ность флуоресценции рибофлавина).

Из каждой колбы с раствором «слепого» опыта берут по 10 мл в пробирки флуороскопа и проводят уравнение флуоресценции «слепого» опыта с флуоресценцией испы-

туемого раствора. Для этого к раствору «слепого» опы­ та прибавляют по каплям из микробюретки стандартный рабочий раствор до тех пор, пока интенсивность флуорес­ ценции раствора «слепого» опыта не сравняется с ин­ тенсивностью флуоресценции испытуемого раствора.

Уравнивание флуоресценции проводят в остальных пробирках «слепого» опыта, из полученных результатов выбирают среднюю величину.

Содержание рибофлавина в исследуемом препарате, а также в штуке драже вычисляют по формулам:

т— содержание рибофлавина в 1 мл рабочего стан­ дартного раствора, мкг;

R — количество стандартного раствора, добавленно­ го к раствору «слепого» опыта, мл;

V— объем основного раствора, в котором растворе­ на навеска, мл;

V\ — объем рабочего испытуемого раствора, мл;

g— навеска, г;

Р— вес штуки драже, г;

100 — коэффициент пересчета в проценты;

1000 — коэффициент пересчета в миллиграммы.

Определение рибофлавина в пищевых продуктах

и других объектах *

Принцип метода. Витамин В2 (рибофлавин) в есте­ ственных продуктах находится в свободном и связанном состоянии. Формы, связанные с белком, не флуоресци­ руют в ультрафиолетовом свете, поэтому для определе­ ния общего содержания рибофлавина (свободного и связанного) необходимо провести освобождение рибо­ флавина из его связанных форм. Для разрыва связи при­ меняют кислотный гидролиз и ферментативные препа­

* Флуорометрический метод определения рибофлавина в пищевых продуктах разработан сотрудниками Института биохимии Ака­ демии наук СССР.

98