Файл: Замятнин, А. А. Дилатометрия растворов белков.pdf

П ри исследовании специфичности аргиназы из печени овцы впер­ вые были количественно связаны процессы расщепления субстрата и изменения объема [57]. G помощью указанного фермента про ­ изводили расщепление равновесового рацемата d- и Z-аргинпыа и одного из оптических изомеров. Д л я характеристики наблюдав­ шегося объемного эффекта было предложено пользоваться вели­ чиной константы сокращения (к), которая характеризует изме­ нение кажущегося мольного объема субстрата при ферментатив­

а также Вебера и Нахмапзона [136, 137], которые явились пред­ посылкой для необычайно тщательных исследований объемных эффектов при протеолизе аминокислот, пептидов и белков, про ­ водившихся под руководством Лнндерштрема - Лапга . В резуль ­ тате таких исследований были получены не только новые данные о

Линдерштрем - Лапг с сотрудниками на основании литературных данных [17, 133—139], а также базируясь на собственных результа­ тах [74, 75, 104, 140], выполненных с помощью модифицирован­ ного двухпузырькового дилатометра, рассмотрели объемные эф­ фекты реакций, в которых происходят различные превращения аминокислот и пептидов [76, 141—143]. В результате этих иссле­ дований оказалось возможным получить величины объемных эф­ фектов, вызванных электрострикцией воды вблизи ионогенных групп растворенных веществ. Средние величины объемных эф­ фектов в системах, содержащих диполярные ионы, такие как аминокислоты и пептиды [140—143], даны ниже:

(4, . . . дип)

50

и карбоксильные группы так близки друг к другу, что пх ре­ зультирующее влияние на окружающие молекулы воды меньше,

пептидов далеко расположенные заряды действуют как индиви­

В табл. 1 даны экспериментально полученные АФ^ значения величии объемных эффектов в реакциях, сопровождающихся образованием ионов и диполяриых ионов аминокислот и пептидов, а т а к ж е величины этих эффектов АФ Т , рассчитанные из данных, приведенных на стр. 50. Заметим, что величина объемного эффек­ та при образовании любой пары аминокислотных ионов везде

изменения электрострикции в реакциях, включающих в себя аминокислоты и малые пептиды, послужили достаточным основа­ нием для экспериментального и теоретического изучения объем­ ных эффектов при гидролизе белков.

ОБЪЕМНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПРИ ГИДРОЛИЗЕ БЕЛКОВ

Собранные нами литературные данные свидетельствуют о том, что,

ротки крови. Результаты этих первых опытов свидетельствовали о том, что гидролиз белков сопровождается уменьшением объема. О величинах ж е объемных эффектов судить было трудно, так как начальные стадии реакции из-за несовершенства техники дилато­ метрии оказались недоступными для исследования.

К настоящему времени дилатометрически исследовано доволь­ но большое число белков, подвергнутых гидролизу. П р и этом ос­ новной результат Галеотти о знаке объемного эффекта подтвер­ дился, несмотря на то что исследовавшиеся белки сильно разли ­ чались по составу и молекулярному весу.

Н а рис. 24, а показан процесс изменения объема, сопровож­ дающего протеолиз казеиногена и желатины трипсином [145],

51

Врет, нин. Время, «ил.

V и с . 24. Процесс изменения объема (а) н количества амшшого азота (6) при протеолпзе казеиногена и желатины трипсином [145]

1 — 2%-ньш казеиноген; 2 — 1%-ный казеиноген;Zß '.— 2%-ная желатина; 4 — 1%-ная желатина

между изменением объема-и изменением количества аминного азо­ та представлена на рис. 25. Т а к и е ж е зависимости изображены на рис. 26 для процесса гидролиза казеиногена и желатины пепсином

гидролиза отрицательные объемные эффекты д л я казеиногена и

дерштрему - Лангу объяснить разнообразные эффекты, характе ­ ризующие протеолиз белков. Основываясь на многих данных, он предложил считать, что при расщеплении пептидных связей в белках электрострикцин не должна превышать

Эта величина включает в себя т а к ж е небольшое дополнителное сокращение ( ~ —3 см3 /моль) за счет возможной добавочной электрострикцин, вызываемой боковыми заряженными группами аминокислотных остатков после расщепления молекулы белка.

Существенное различие в величинах объемных эффектов было обнаружено при сравнительном исследовании белков, сильно

52

р и с. 25. Взаимосвязь между процессами уменьшения объема н увеличения аминного азота при протеоліізе казеиногена и желатины трипсином [145]

j — 4—то же, что на рис. 24

Р и с . 2в. Взаимосвязь между процессами уменьшения объема н увеличения амііпного азота при протеолнзе назе"ногсна п телатины пененном [140]

1 — 2.84%-ныіі казеиноген; 2 — 1.46%-ный

к^зеиногснГзА"^'з'''?Г?іая желатина; 4 — « %-ная желатина

/ООО

Р и с . 27. Уменьшение объема при протео­ лнзе трипсином ß-лактоглобу.иша н илупсина [143, 147]

Число расщепленных связей.

характеризуется отрицательным объемным эффектом, лежащим в пределах 15—20 см3 /моль. Согласно результатам, полученным при расщеплении пептидов, величины этих эффектов легко могут быть, объяснены электрострикцнонным эффектом, сопровождающим раз ­ рыв пептидных связей. Т а к и м образом, объемные эффекты, обус­ ловленные иными причинами, дл я ьлупеина составляют не­ более 2—3 см3 /моль.

В то ж е время уменьшение объема, сопровождающее расщеп ­ ление пептидных связей в более высокомолекулярном и обладаю­

В связи с тем, что дополнительное сокращение в сильной сте­ пени связано с начальными стадиями протеолиза, Линдерштрем - Ланг особенно подчеркивал важность «обнаженных» и, таким об­ разом, доступных в первые моменты протеолиза для фермента пеп­ тидных связей субстрата, после разрыва которых доступными ста­ новятся и остальные.

К а к следует из результатов, полученных при 40° С, общее из ­ менение объема ß-лактоглобулина при исчерпывающем расщеп­ лении трипсином равно —1400 см3 /моль белка, а полное число расщепляемых пептидных связей составляет 35. Тогда объемный і эффект, обусловленный появлением электрострикции за счет об­ разования ионных аминных и карбоксильных пар, согласно у р а в ­ нению (30), должен быть равен 35•(—20) = —700 см3 /моль. Ка ­ ким ж е образом объяснить то, что наблюдаемая величина на 700 см3 /моль больше?

Частично это дополнительное изменение объема пытались объяснить разрушением вторичной структуры белка [147, 148], как необходимой предпосылкой для расщепления той части пептид­ ных связей, которая недоступна ферменту при структурной ор­ ганизации субстрата в нативном состоянии. Действительно, было показано, что при денатурации яичного альбумина 6—8 M моче­ виной при 30° С происходит уменьшение объема на 300—

54