Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

В этих условиях полностью ацилируется и триптофан [115]. Меньшая ацилирующая способность уксусного ангидрида не позволяет проводить ацетилирование хлоргидрата гуанидиниевой группы в аналогичных условиях. Тем не менее мы получили пригодное для ГХ ацетильное производное, нейтрализовав хлоргидрат я-пропилового эфира перед ацетилированием карбона­ том щелочного металла или, что еще лучше, дауэксом-1 (в ОН~-форме) в абсолютном я-пропаноле. Данные анализа произ­ водных аргинина и гистидина на носителе хромосорб W (высоко­ качественный, фирма «Johns-Manville») с 3% жидкой фазы OV-17 приведены на рис. 1. На хромосорбе G (в. к.) с той же жидкой фазой не удается получить пик аргинина [23]. Производ­ ные аргинина и гистидина не будут элюироваться ни с одного из носителей, покрытых карбоваксом.

2.4.4.Превращение аргинина в орнитин и гистидина

васпарагиновую кислоту

Вполне очевидно, что для смесей, содержащих различные неизвестные аминокислоты, желательно иметь стандартные условия этерификации и ацилирования. До сих пор оказывалось невозможным ацетилировать аргинин и гистидин в тех же условиях, что и другие аминокислоты. Для решения этой проб­ лемы мы избрали превращение аргинина в орнитин и гистидина в аспарагиновую кислоту. Обе эти реакции специфичны, что позволяет использовать их для сложных смесей аминокислот

Таблица 2

РАСЩЕПЛЕНИЕ АРГИНИНА ДО МОЧЕВИНЫ ( + ОРНИТИН) АРГИНАЗОИ а)

Во всех случаях прибавляли 20 мкг фермента. Мочевину определяли колоримет­ рически с диацетилмоноксим-тносемикарбазилным реагентом по калибровочному графику.

® По I молю пролива, треонина, серина, аспарагнновоА и глутаминовой кислот, метионина и фенилаланина.

8 Лизни.

и получать производные обычным образом в стандартных условиях.

Превращение аргинина в мочевину и орнитин контролиро­ валось по образованию мочевины после активирования арги­ назы сульфатом марганца при pH 7,8. Для активации аргиназы

(«Worthington Biochemical») 1 мг фермента инкубировали при

37 °С в течение 4 ч с 0,5 мл 0,1 М ацетата аммония при pH 7,8 и 0,5 мл 0,5 М MnSC>4. Перед употреблением раствор активиро­

хлоргидрата аргинина в 0,5 мл ацетата аммония с той же ве­ личиной pH [23]. Приведенные в табл. 2 экспериментальные данные свидетельствуют о количественном ферментативном расщеплении даже в присутствии большого избытка других аминокислот.

Озон вызывает расщепление С= С-связи в имидазолах [76], вследствие чего гистидин превращается в аспарагиновую кис­

Для исследования количественной стороны реакции озон (полученный при высоковольтном разряде в токе чистого кис­ лорода) пропускали над 10-7 моля гистидина в 0,1 н. НС1

втечение 15 мин перед превращением в N-ацетил-н-пропильное производное (разд. 2.4.8). Образующуюся аспарагиновую кис­ лоту растворяли в 100 мкл этилацетата и 1 мкл (теоретически соответствующий 10'9 моль) подвергали газохроматографиче­ скому анализу. Степень превращения гистидина в аспараги­ новую кислоту, рассчитанная по отношению к площади пика 10-9 моль аутентичного образца аспарагиновой кислоты, оказа­ лась равной 96%. Для количественной оценки смесей, содер­ жащих аспарагиновую кислоту и гистидин, хроматографируют озонированный и неозонированный образцы. При этом разница

вмолярном содержании аспарагиновой кислоты служит мерой количества гистидина в смеси.

2.4.5.Устойчивость ацилированных аминокислот

Склонность к деацилированию у ацилзамещенных О-, S-, дополнительных NH2, имидазольной и гуанидиновой групп на­ много выше, чем у a-NH2-rpynn, причем ТФА-производные в этом отношении намного чувствительнее соответствующих аце­ тильных соединений. Эти свойства имеют решающее значение при выборе жидкой фазы и носителя для ГХ. Было показано, что в водной среде ди-ТФА-серин быстро превращается в мо­ но (N)-ацильное производное [144]. При достаточно длительном воздействии N-ТФА-серин в конце концов снова превращается в нативную аминокислоту, что, как полагают, связано с N—>0 ацильной миграцией. Ди-ТФА-производные оксипролина, сери­ на, треонина, тирозина и цистеина тоже быстро разлагаются до N-ТФА-соединений в метаноле, воде и даже в некоторых тщательно высушенных растворителях (бензол, хлористый эти­ лен и н-амилтрифторацетат) [28, 84, 99]. При этом наиболее лабильны производные тирозина, а наиболее устойчивы (3-0- ТФА-группировка треонина и производное по индольному атому азота триптофана. Наблюдаемые в ГХ метанольных рас­ творов метиловых эфиров ТФА-аминокислот большие времена удерживания для серина и тирозина согласуются с их разло­ жением до свободных ОН_-форм. Еще одним доказательством лабильности О- и S-ТФА-тирозина и цистеина служит их спо­ собность к ацилированию к-амилового эфира изолейцина. Трео­ нин, серин и оксипролин в этом отношении были неактивны [28]. н-Бутиловый эфир ди-ТФА-гистидпна оказалось целесооб­ разным хроматографировать, полностью разлагая его бутано­ лом на газохроматографической колонке до моно-ТФА-произ- водного [43] (см. также разд. 2.7.3).

Несмотря на утверждение о том, что этерификация раство­ ром НС1 в пропаноле может проводиться после ацетилирования аминокислот уксусным ангидридом в уксусной кислоте [52], этот метод применим исключительно к аминокислотам, имею­ щим только а-ЫН2-группы. Мы обнаружили, что при этерифи­ кации-смесью пропанол — НС1 О-ацетилсерин, -треонин, -тирозин и e-NH-ацетиллизин полностью разрушаются (это относится к ТФА-метиловым эфирам [25]). Нами было также показано, что в отличие от ди-ТФА-производных н-пропиловые эфиры диацетиламинокислот (за исключением гистидина) относи­ тельно устойчивы в присутствии спирта (табл. 3).

В безводных условиях эфиры ТФА- и ацетиламинокислот имеют хорошую термическую устойчивость (+200°С) [28, 144], тем не менее металлические инжекторы, по-видимому, вызы­ вают разложение О-ТФА-производных, в особенности производ­ ных тирозина и треонина [41, 78]. Соответствующие ацетильные