Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

122]. К воспроизводимым выходам приводит использование 10—20%-ного тионилхлорида (2 ч при 40°С). Реакция протекает через промежуточное образование диметилсульфита (см. выше), являющегося активным донором метальных групп.

2.4.1.4.Этерификация диазометаном

Обработка диазометаном применялась для этерифицирования малых количеств аминокислот. Интересная особенность этого метода состоит в том, что его с успехом использовали для некоторых N-ацилированных аминокислот [54, 69, 82, 88, 130]. Несмотря на имеющееся сообщение о низких выходах [130], большинство других авторов считает, что реакция яв­ ляется количественной [82]. Аналогичной реакцией с фенилдиазометаном получены бензиловые эфиры аминокислот [27].

2.4.1.5.Этерификация катионообменными смолами

вкачестве катализаторов

Показано, что в Н+-форме эти смолы катализируют этери­ фикацию олеиновой кислоты я-бутанолом [123]. Изучалась и ки­ нетика этой реакции [81]. Аналогичным образом, кипячением с соответствующим спиртом в присутствии дауэкса-50 или дру­ гого сильного катионообменника, получены эфиры аминокислот [85, 89, 92, 108]. Методом тонкослойной хроматографии пока­ зано отсутствие неэтерифицированных кислот в н-бутиловых эфирах, элюированных со смолы нитратным буфером pH 6,95 [85]. Таким способом было получено 11 бутиловых эфиров, од­ нако не для аминокислот, с трудом этерифицируемых другими методами.

2.4.1.6.Разные методы этерификации

Кроме трехфтористого бора [96], имеются ссылки на ис­ пользование хлористого бора и n-толуолсульфокислоты как ка­ тализаторов этерификации [78].

2.4.2.Получение эфиров аминокислот в виде свободных оснований

Этерификация в присутствии НС1 (НВг) приводит к обра­ зованию хлоргидрата (бромгидрата) аминокислоты, которые недостаточно летучи для использования в ГХ. В случае про­ стых аминокислот нейтрализация соли слабой щелочью или, что еще лучше, ионообменной смолой дает летучий свободный амин.

Из хлоргидратов метиловых эфиров аминокислот свободные основания получали обработкой NaOH [5] или анионообменной смолой (дауэкс-1 в ОН_-форме), суспендированной в абсолют­ ном метаноле [93]. (Присутствие влаги представляет серьезную опасность омыления эфира в результате освобождения со смолы свободных ОН-ионов, являющихся гидролитическими цент­ рами.) Свободные основания считаются достаточно устойчивы­ ми при хранении.

Хлоргидраты эфиров некоторых аминокислот хроматографи­ ровали путем включения аммиака в состав газа-носителя [109]. Хроматографировались также свободные основания и соли — хлориды и ацетаты [93]. При повышенных температурах аце­ таты (с меньшей легкостью хлориды) дают на хроматограмме пики, аналогичные по временам удерживания и площади пику соответствующего свободного основания, что свидетельствует о термической диссоциации соли при нагревании. Диссоциация не наблюдалась у эфиров лизина и аргинина, тогда как ме­ тиловый эфир цистеина давал с хорошим выходом пик в виде ацетата, но не свободного основания. Тирозин, триптофан и ги­ стидин не удалось хроматографировать ни как свободные осно­ вания, ни как ацетаты.

2.4.3.Ацилирование амино- и других функциональных групп

Реакции ацилирования обычно проводят с ангидридами или хлорангидридами кислот, часто в присутствии пиридина или хи­ нолина, реже с другими третичными аминами. В реакции с сим­ метричным ангидридом получается соответствующая кислота:

(RC0)20 + H2NR' — >• RCONHR' + RCOOH

Щелочные условия не являются обязательными — реакция про­ текает и в кислой среде, особенно когда это касается' первич­ ных аминов. Для предотвращения образования аминоацильных производных берут разбавленный ангидрид. Другие полярные группы, способные ацилироваться вместе с главными амино- (или имино)-группами, общими для всех аминокислот, вклю­ чают ОН-группы серина, треонина, оксипролина и тирозина,- ЫНг-группы боковых цепей орнитина и лизина, SH-группу ци­ стеина, а также имидазольную, гуанидиновую и индольную группы гистидина, аргинина и триптофана соответственно. В особых условиях можно получить диацильные производные всех этих аминокислот, за исключением аргинина; при введе-. нии двух ацильных групп в гуанидиновое ядро получаются три-, ацильные производные.

скольких часов). Имеются разногласия относительно легкости, с которой реагируют дополнительные функциональные группы аминокислот, и устойчивости получающихся ацильных произ­ водных (см. разд. 2.4.5). Серьезные затруднения часто возни­ кали в случае основных аминокислот (лизина, орнитина, арги­ нина и триптофана). При действии трифторуксусного ангидрида в трифторуксусной кислоте орнитин, лизин и аргинин ацилируются только по a-NH2-rpynne [136]. Более эффективным было ацилирование хлоргидратов аминокислот неразбавленным три-' фторуксусным ангидридом [25, 26, 85, 130] или же трифторуксусным ангидридом, разбавлявшимся хлористым метиленом или этилацетатом [41, 84, 100, 150]. N, О-ди-ТФА-серин и трео­ нин, а также другие бифункциональные аминокислоты были получены с высоким выходом при использовании двух-пяти- кратного молярного избытка реагента [84, 144]; при этом пи­ ридин, после упаривания которого остается коричневый сироп, как основной растворитель непригоден [15]. При комнатной температуре все аминокислоты, кроме аргинина, трифторацетилируются в хлористом метилене за 2 ч, а при 150°С реакция завершается в 5 мин [115].

2.4.3.5.Ацилирование аргинина, гистидина и триптофана

Этерификация аргинина и гистидина смесью кислота — спирт приводит к дихлоргидратам, в образовании которых уча­ ствуют гуанидиновая и имидазольная группы. Если источником аминокислот служит кислотный гидролизат, то эти соли при­ сутствуют до этерификации. Использование диазометана не ре­ шает, следовательно, обсуждавшуюся выше проблему солеобразования, снижающего летучесть и в случае аргинина препят­ ствующего полному ацилированию. Важное влияние солеобразования на ацилирование, летучесть и газохроматографическое поведение, по-видимому, недооценивалось, и в отношении ами­ нокислот высказывалось много вводящих в заблуждение про­ тиворечивых утверждений.

При трифторацетилировании гистидина метиловым эфиром трифторуксусной кислоты в присутствии триэтиламина образо­ вывалась триэтиламмонийная соль; обессоливание проводи­ лось на амберлите ХЕ-64 [145]. Сведения о том, является про­ дукт моноили диацилированным, отсутствовали. Важная работа Макасуми и Сароф [84], в которой описаны методы по­ лучения в больших количествах высокоочищенных метиловых эфиров ТФА-аминокислот и их свойства, подтвердила, что вы­ деленное производное гистидина, перекристаллизованное из

Рис. 1. ГХ-разделение ацетил-к-пропильных производных гистидина и арги­ нина (1,5- 10- 8 М).

Ацетилирование проводилось после нейтрализации хлоргидратов эфиров NajCO,. Колонка стеклянная, длина 40 см, внутренний диаметр 3 мм; Зк OV-17 на носителе хромосорб W (в. к.); газ-носитель азот, скорость потока 30 мл/мин; 170—250 °С, при 10 °С/мин.

ангидридом в этилацетате.) Очевидно, его вводили в виде ТФАсоли, которая при нагревании диссоциировала и давала слабый пик. Тем не менее было высказано предположение, что произ­ водное гистидина, которое можно было получить в растворе (но не выделить) и которое поддавалось газохроматографическому анализу, представляет собой диацильное (N,N'-TOA) соеди­ нение .(IV). Соединение это очень лабильно (см., однако,

разд. 2.7.3).

Авторы этой главы сообщали также, что из дихлоргидрата пропилового эфира гистидина при ацетилировании уксусным ангидридом в пиридине нельзя получить пригодный для ГХ продукт [23]. Если же ацетилирование проводилось после ней­

(в. к.), покрытом 3% OV-17. Методика вряд ли пригодна для це­ лей количественного анализа.

Несмотря на утверждение о том, что для аргинина хрома­ тографические пики получаются после трифторацетилирования при комнатной температуре [56], обычно необходимо проводить ацилирование трифторуксусным ангидридом при 100—150 °С [25, 29, 115] или же в присутствии безводного карбоната нат­ рия [30] и диметилформамида [150]. Методику [39] считают не­ удовлетворительной, поскольку в известной степени происходит превращение аргинина в орнитин. После ацилирования дихлор­ гидрата метилового эфира аргинина при комнатной темпера­ туре трифторуксусным ангидридом в этилацетате элементный

отличить три-ТФА-соединение (V) от ди-ТФА-трифторуксусной соли (VI) [84].

Шталлинг и Герке довольно подробно рассмотрели проблемы ацилирования аргинина и пришли к выводу, что трифторацетилирование при комнатной температуре дает гуанидиниевую соль, недостаточно летучую для ГХ. Если ввод пробы в испа­ рители (особенно металлические) проводят в присутствии из­ бытка трифторуксусного ангидрида, то при высокой темпера­ туре в какой-то степени образуется три-ТФА-соединение (V) (см. также ссылку [25]) и иногда наблюдают соответствующий пик. (При этом большое значение имеет набивка колонки и выбор жидкой фазы.) В результате разложения, происходя­ щего в той или иной степени в импульсных нагревателях, обра­ зуются некоторые количества орнитина. Полностью ацилированное производное аргинина, не проявляющее тенденции к