Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

2.7.ПРИЛОЖЕНИЕ

2.7.1.Носители и жидкие фазы

После того как была написана данная глава, появилось не­ сколько работ, рассматривающих взаимодействие носителя, жидкой фазы и производных. Без детального понимания этих взаимодействий невозможно разработать стандартную мето­ дику покрытия колонок, приводящую к абсолютно воспроизво­ димым хроматограммам.

Так как при более длительном кондиционировании колонок разделение улучшалось [159], авторы полагали, что важное зна­ чение имело удаление воды из носителя. Соответственно были проведены опыты, в которых носитель (п. к. хромосорб-W) на­ гревали в различных временных и температурных условиях. Предлагаемое объяснение не является, по-видимому, исчерпы­ вающим, поскольку адсорбированная вода удалялась бы в ходе нормального кондиционирования, а покрытые силанизированные носители, которые не должны адсорбировать воду, обнаружи­ вают аналогичное улучшение разделения при медленном конди­ ционировании. Вероятно, нагревание носителя приводит к изме­ нению поверхности, что влияет на распределение жидкой фазы. Метод высушивания носителя в ходе покрытия также оказы­ вает воздействие на разделение. В случае вязкой жидкой фазы разжиженная набивка дает лучшее разделение, чем высушенная в комках [157]. Согласно первой методике, ток предварительно нагретого азота пропускают снизу вверх через влажную набивку что создает впечатление слабого кипения покрытого носителя. Тем не менее даже при очень тщательной стандартизации ме­ тода покрытия наблюдается расхождение в свойствах между от­ дельными партиями одного и того же носителя [156]. Поэтому неудивительно, что необъяснимые отклонения от обычного раз­ деления продолжают досаждать специалистам и обескуражи­ вают начинающих.

2.7.2.Эфиры ацилированных аминокислот

Появились новые данные [23] о том, что изолейцин трудно этерифицируется при слишком малых концентрациях HCI в спирте (в конкретном случае — в бутаноле [161]). Подтверждена также деструкция триптофана в ходе этерификации и вытекаю­ щая отсюда необходимость в стандартизации концентрации НС1, времени и температуры для количественного определения трип­ тофана. Было показано, что для получения «-бутиловых эфиров подходящей является ЗМ концентрация НС1, при которой отпа­ дает необходимость в переэтерификации.

Продолжая свои тщательные исследования, Ислам и Дарбр улучшили разделение метиловых эфиров N-ТФА-аминокислот (за исключением гистидина) на смешанной силиконовой не­ подвижной фазе, состоящей из ХЕ-60 — QF-1 — МС-200, 100 сСт (46:27:27), на диатопорте-S, комбинируя программирование температуры и изотермический процесс [156]. Высокоочищенные радиоактивные «-бутиловые эфиры N-ТФА-аминокислот полу­ чали после хроматографии на силикагеле [163]. При хроматогра­

целит 560, не вся радиоактивность была связана с пиком элюи­ руемой аминокислоты [151]. Значительная доля активности рас­ пространялась по оставшейся части хроматограммы, главным об­ разом после соответствующего пика. Исключение составлял ме­ тиловый эфир ТФА-фенилаланина: 13,1% активности выходило перед элюированием производного, причем активность не была связана со вторым пиком. Метиловый эфир фенилаланина более летуч, чем соответствующее ТФА-производное, поэтому отмечен­ ное явление согласуется с медленным непрерывным разложе­ нием последнего на колонке. Следует подчеркнуть, что это на­ блюдение относится только к данной жидкой фазе и данному но­ сителю. К сожалению, отсутствуют сопоставимые исследования других производных, носителей и жидких фаз.

2.7.3.Гистидин

«-Бутиловый эфир ди-ТФА-гистидина предохраняли от частич­ ного деацилирования путем введения на колонку в избытке трифторуксусного ангидрида. Однако на жидких фазах типа OV это производное элюируется вместе с аспарагиновой кислотой [160]. Авторы работы утверждают, что ди-ТФА-пропзводное можно легко превратить в моно-ТФА-производное, упаривая из­ быток трифторуксусного ангидрида в токе азота. После нанесе­ ния этот менее летучий продукт удерживается в верхней части колонки до тех пор, пока его снова не превращают в эфир

ди-ТФА-гистидпна, вводя трифторуксусный ангидрид. При тща­ тельно выбранном времени введения пробы ресиптезнрованпый летучий эфир можно элюировать в свободной части хромато­ граммы. Кажется удивительным, если принять во внимание ме­ тод получения моноацилпроизводных, что диацильное производ­ ное достаточно устойчиво в токе горячего газа-носителя. Гисти­ дин (наряду с аргинином, триптофаном и цистином) определяли в виде ТМС-производного на колонках с хромосорбом G (в. к.), покрытым смешанной фазой из 3% OV-17 и 1.5% OV-22 [160].

2.7.4.Озонолиз гистидина

Несколько исследователей сообщали о трудностях, связан­ ных с количественным превращением гистидина в аспарагино­ вую кислоту путем озонолиза. Эта реакция зависит от pH, тем­ пературы и концентрации. Для обеспечения 100%-ной конверсии при любом времени используется следующая модификация опу­ бликованного метода [23].

Образец, приблизительно 0,1 мл раствора 0,1 н. НС1, по­ мещается в пробирку для получения производных. Эта пробирка соединена с прибором, аналогичным изображенному на рис. 8, но без воронки. Присоединяют ток газа из озонатора (скорость кислорода 40 мл в минуту, 0,8—1% 0 3), а нижнюю часть про­ бирки погружают в жидкий азот на глубину 1 см. При этом видно, как конденсируется голубой озон с некоторым количест­ вом кислорода. Через 5 мин ток газа закрывают, а пробирку поднимают над самой поверхностью азота, чтобы происходила фракционная перегонка. Когда весь озон улетает, прибор закры­ вают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, а за­ тем в закрытом виде нагревают 5 мин при 100 °С. После этого образец высушивают в токе азота и обычным образом переводят в соответствующее производное.

2.7.5.Комбинированная ГХ-масс-спектрометрия

Опубликованы данные о масс-спектрометрии N-ТФА-бутило- вых эфиров [154]. Уникальные пути фрагментации индивидуаль­ ных аминокислот позволяют с уверенностью идентифицировать плохо разрешенные пики. Эта работа продемонстрировала цен­ ность масс-спектрометра как очень чувствительного (хотя и до­ рогого) идентифицирующего детектора.

2.7.6.ТМС-аминокислоты

Недавно Герке и сотр. [153] разделили ТМС-производные всех 20 обычных аминокислот, синтезированные с использова­ нием 30-молярного избытка БСТФА в равном соотношении g

ацетонитрилом. Производные четырнадцати аминокислот полу­ чали при 135"“С в течение 15 мни и анализировали на колонке с 3% OV-17 и 1,5% OV-22, нанесенными на хромосорб G (в. к.), Глутаминовая кислота, аргинин, лизин, гистидин, триптофан и цистин разделялись на той же колонке после силилирования в течение 4 ч при 135°С. Каждый хроматографический опыт про­ должался почти 70 мин. Глицин с тремя ТМС-группами плохо отделяется от изолейцина и пролина, что делает невозможным количественный анализ глицина в тех смесях, где он присутст­ вует в избытке (например, в моче). Хотя силилирование являет­ ся простой одностадийной операцией, неспецифичность этой реакции все еще служит источником осложнений. Для получе­ ния производных из мочи потребовалась обработка катионо- и анионообменниками.

2.7.7.Иодаминокислоты

ТМС-производные иодаминокислот успешно разделяли на коротких колонках с OV-17, при этом зависимость сигнала де­ тектора линейна в пределах концентрации 10_6—10~9 моля [152]. Выделение иодаминокислот из сыворотки было значительно улучшено на сефадексе LH-20. Однако для полного использова­ ния чувствительности электронозахватного детектора и анализа очень малых количеств сыворотки (< 1 мл) было необходимо экстрагировать производные из смеси, в которой они синтезиро­ вались. Разделение удавалось с помощью повторной хромато­ графии на сефадексе LH-20, но выход составлял около 50% [162].

Недавно появился на итальянском языке обзор газовой хро­ матографии аминокислот, ее исторического развития и приме­ нения [158].

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Alexander N. М., Sclteig R., Anal. Biochem., 22, 187 (1968).

2.Aue W. A., Gehrke C. №., Tindle R. C., Stalling D. L., Ruyle C. £>., J. Gas Chromatog., 5, 381 (1967).

3.Backer E. T., Pileggi V. J., J. Chromatog., 36, 351 (1968).

4.Baraud J.. Bull. Soc. Chim. France, 1, 785 (1960).

5. Bayer E., Reuther К. H., Born F., Angew. Chem., 69, 640 (1957).

6.Bier M., Teitelbaum P., Federation Proc., 17, 191 (1958).

7.Bier M., Teitelbaum P., Ann. N. Y. Acad. Sci., 72, 641 (1959).

8.Birkofer L., Donike M., J. Chromatog., 26, 270 (1967).

9.Birkofer L„ Ritter A., Chem. Ber., 93, 424 (1960).

N.A. Szymanski, Plenum Bublishing Corp, New York, 1968.

12.Blqu /(., Darbre A., Biochem. J., 88, 8P (1963).