Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

Рис. 1. Газохроматографнческое разделение синтетической смеси N-ТФА- метиловых эфиров аминокислот и днпептидов.

современных исследований в этой области и оказывается необ­ ходимой, если предстоит анализ смеси неизвестных пептидов, что представляет собой, например, частичный гидролизат белка. В то время как идентификация аминокислот и дипептидов в принципе возможна путем измерения относительного удержива­ ния, индексов удерживания или же введением стандартов, эта процедура кажется неосуществимой для исследования высших пептидов из-за громадного числа вероятных соединений. Напри­ мер, если взять только 10 аминокислот, то их комбинация может привести к 100 дипептидам и 1000 трипептидам.

Использование масс-спектрометрии для анализа пептидов впервые предложено Штенхагеном [2], а позднее наиболее полно Вейгандом, Проксом и сотр. [3—7] на примере метиловых эфи­ ров N-ТФА-пептидов после того, как соединения разделяли р

50 м • 0.25 мм, подготовленный по Гробу |21] и покрытый полнпропнленглнколевой ж идкой

помощью ГЖХ и улавливали на выходе из колонки. Имеются также сообщения Ледерера [8] и Шемякина [9] о масс-спектро- метрин пептидов, но, так как масс-спектрометрическим аспектам посвящена гл. 4 этой книги, здесь, они больше обсуждаться не будут.

Газохроматографический анализ производных пептидов впер­ вые описан в 1960 г. в работе Вейганда, Кольба, Прокса и Томиды [10]. Эти авторы несколькими опытами продемонстриро­ вали главные задачи, все еще остающиеся актуальными, —

разделение диастереомеров, важное для изучения рацемизации, и анализ частичных гидролизатов с целью установления после­ довательности. О роли масс-спектрометрии в дальнейшей иден­ тификации улавливаемых соединений уже говорилось.

Впоследствии в ряде исследований метод ГЖХ получил бо­ лее широкое применение в этой области. Помимо ряда специ­ альных случаев они касались применения ГЖХ для выяснения аминокислотной последовательности в некоторых пептидах и исследования рацемизации в пептидном синтезе. Рассмотрим теперь эти вопросы более подробно.

3.2.ПОЛУЧЕНИЕ ЛЕТУЧИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Так как свободные аминокислоты и пептиды недостаточно летучи, прежде чем начинать ГЖХ, их нужно превратить в летучие производные. Получение производных — это главная проблема, которая решена до сих пор еще не для всех пептидов. Часть трудностей возникает из-за того, что многие важные ами­ нокислоты в пептидной цепи наряду с а-амино- и карбоксиль­ ными группами содержат ряд других функциональных групп. В результате получаются производные, сильно различающиеся по летучести; кроме того, часто протекают осложняющие побоч­ ные реакции. Так как нет принципиальных отличий в методах получения летучих производных аминокислот и пептидов, можно ожидать, что результаты и опыт работы с производными амино­ кислот будут способствовать развитию аналогичных методов и для соответствующих пептидов. Пока недоступными для ГЖХ анализа являются пептиды, содержащие гистидин, аргинин или аминокислоты (подобно аспарагину и глутамину) с дополни­ тельной функциональной амидной группой. В отличие от амино­ кислот при анализе пептидов исследователь встречается с осо­ быми' эффектами, вызываемыми более высокими молекулярными весами пептидов и связанной с этим пониженной летучестью. Чтобы компенсировать низкую летучесть, приходится пользо­ ваться только такими защитными группами, которые очень устойчивы при высоких температурах, значительно увеличивают летучесть и легко доступны. Эти условия ограничивают приме­ нимость к пептидам большого числа защитных групп, исполь­ зуемых для аминокислот.

Биман и Веттер [11] разделили методом ГЖХ аминоспирты, образующиеся при восстановлении этиловых эфиров N-ацилпеп- тидов литийалюмогидридом. Для идентификации они исполь­ зовали масс-спектрометршо, однако сообщения о дальнейшем применении этого метода отсутствуют,

3.2.1.Защита аминогруппы

По нескольким причинам для защиты аминогруппы в ГЖХ использовалась, за редким исключением, трифторацетильная группа. Трифторацетильные производные эфиров аминокислот и пептидов очень устойчивы при высоких температурах, а три­ фторацетильная группа придает большую летучесть, чем любая другая замещенная ацетильная группа [12]. Только гептафторбутирильные производные имеют более высокую летучесть [13], но они не нашли пока широкого применения, хотя в сочетании с масс-спектрометрией [77] и кажутся привлекательными из-за того, что соответствующие производные эфиров пептидов можно разделять при меньших температурах колонки и меньшей утечке колонки.

Так как для ГЖХ-анализа необходимо большое количество стандартных соединений, которые, как правило, нельзя купить и нужно синтезировать, то следующее важное преимущество трифторацетильной группы состоит в том, что это обычно ис­ пользуемая защитная группа в пептидной химии. Если трифтор­ ацетильная защитная группа применена для синтеза, то обра­ зующиеся метиловые эфиры можно непосредственно использо­ вать в качестве пептидов-стандартов для газохроматографиче­ ского анализа. Если в синтезе применяется хорошо известная карбобензоксигруппа, ее следует заменить на трифторацетильную действием трифторуксусиой кислоты [14], хотя даже мети­ ловые эфиры карбобензоксидипептидов пригодны для ГЖХ [15]. Интерес могли бы представлять и некоторые другие производ­ ные, но так как до настоящего времени в достаточной степени исследовали лишь N-ТФА-производные пептидов, они и буцут рассматриваться в этой главе. Трифторацетилирование проводят или метиловым эфиром трифторуксусиой кислоты с триэтиламином в слабощелочном растворе [10], или трифторуксусным ангид­ ридом [16]. В этих же условиях вместе с а-аминогруппой трифторацетилированию подвергается вторая аминогруппа в боко­ вой цепи лизина и орнитина.

3.2.2.Защита карбоксильной группы

До сих пор для пептидов использовались исключительно ме­ тиловые эфиры. Этерифицируют обычно или перед ацилирова­ нием, в абсолютном метаноле с сухим газообразным НС1, что приводит к образованию хлоргидратов метиловых эфиров соот­ ветствующих пептидов, или же после ацилирования — с помощью диазометана. Если соединение содержит дополнительные кар­ боксильные группы, как, например, глутаминовая или аспараги­ новая кислоты, то они хорошо метилируются в тех же условиях.

Хлоргидраты метиловых эфиров образуются непосредственно при частичном гидролизе пептида, если он проводится в метанольном растворе хлористого водорода.

3.2.3.Защитные группы для третьей функциональной группировки

Если исследуемый пептид содержит аминокислоты с третьей функциональной группой, то простых производных — метиловых эфиров N-ТФА-пептидов — оказывается недостаточно.

Метиловые эфиры N-ТФА-пептидов с гидроксилсодержащими аминокислотами (такими, как серин, треонин или оксипролин) лучше всего превращаются в триметилсмлильные (ТМС) произ­ водные при кипячении с гексаметилдисилазаном в течение при­ близительно 20 мин [17]. Без силилирования наблюдались мно­ гочисленные пики, обусловленные разложением. Метиловые эфиры N-ТФА-пептидов, содержащих тирозин, дают асимметрич­ ные пики [17], возможно, из-за сильных водородных связей фе­ нольной оксигруппы. Несмотря на то, что эта проблема может быть решена метилированием диазометаном, силилирование и в этом случае является предпочтительным. Серин- и треонинсо­ держащие пептиды нужно силилировать в любом случае, а ти­ розин в соответствующих пептидах силилируется в тех же усло­ виях.

Определенные трудности встречались при работе с цистеин­ содержащими пептидами, так как они разлагаются в условиях, обычных для ГЖХ-аиализа. По этой причине свободная меркаптогруппа должна быть защищена, чтобы избежать р-элиминиро- вания, а также окисления до дисульфидной связи. Байер и Кё­ ниг [18] применили с этой целью S-бензильпую группу и описали ГЖХ анализ эфиров некоторых N-ТФА-дипептидов и трипептндов. Исследуемый пептид бензилировали перед частичным гид­ ролизом, который проводили концентрированной соляной кисло­ той при 37°С в течение 72 ч. После упаривания в вакууме, эте­ рификации диазометаном и трифторацетилировання проводили анализ с помощью ГЖХ и масс-спектрометрии.

Вейганд и сотр. [17] предлагали проводить десульфирование путем нагревания пептидов с никелем Ренея в 90%-ном мета­ ноле, в результате чего из каждого остатка цистеина образуются производные аланина. Все другие серусодержащме аминокис­ лоты также претерпевают элиминирование серы; метионин, на­ пример, превращается в а-аминомасляную кислоту. Другим примером из работы Вейганда и сотр. [17] является определение последовательности глутатиона. Тетраэтиловый эфир дисуль­ фида ди-И-ТФА-глутатиона сначала десульфировали, а затем после частичного гидролиза, метилирования и трифторацетили-