Файл: Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков..pdf

13.Blau К., Darbre A., J. Chromatog., 17, 445 (1965).

14.Blau К., Darbre A., J. Chromatog., 26, 35 (1967).

15. Bourne E. J., Tallow С. E. M., Tatlow J. C., J. Chem. Soc., 1950, 1367.

16.Bowman R. £., J. Chem., Soc., 1950, 1349.

17.Burlingame T. G., Pirkle 97. H., J. Am. Chem. Soc., 88, 4294 (1966).

18.Caldwell /{. A., Tappel A. £., J. Chromatog., 32, 635 (1968).

25.Cruickshank P. A., Sheehan J. C., Anal. Chem., 36, 11191 (1964).

26.Darbre Л., Blau K., Biochem. J., 88, 8P (1963).

27.Darbre A., Blau A., J. Chromatog., 17, 31 (1965a).

28.Darbre A., Blau /(., Biochim. Biophys. Acta, 100, 298 (1965b).

29.Darbre A., Blau K., J. Chromatog., 29, 49 (1967).

30.Coulter J. R., personal communication, 1966.

31.Davis 1. 117., Jr., Furst A., Anal. Chem., 40, 1910 (1968).

32.Dorlet C., Bull. Soc. Chim. Belg., 72, 560 (1963).

33.Dose K., Nature, 179, 734 (1957).

34.Edman P., Acta Chem. Scand., 4, 283 (1950).

35. Ertinghausen G., Gehrke C. 117., Aue H7. Л., Separ. Sci., 2, 681 (1967).

36.Fates H. M., Pisano J. J., in «Biomedical Applications of Gas Chromato­ graphy», Ed. by H. A. Szymanski, Plenum Publishing Corp., New York, 1964, p. 39.

37.Feibush B., Gil-Av E., J. Gas Chromatog., 5, 257 (1967).

38.Fischer £., Ber. Deut. Chem. Ges., 39, 530 (1906).

39. Gehrke C. 97., Lamkin 117.. M., Stalling D. £., Shahrokhi £., Biochem. Biophys. Res. Commun., 19, 328 (1965).

40.Gehrke C. 97., Shahrokhi £., Anal. Biochem., 15, 97 (1966).

41.Gehrke C. 97., Stalling D. £., Separ. Sci., 2, 101 (1967).

42.Gehrke C. 97., Stalling D. L., Ruyle C. D., Biochem. Biophys. Res. Com­ mun., 28, 869 (1967).

51(1966).

46.Gil-Av £., Feibush B., Tetrahedron Letters, 35, 3345 (1967).

47. Gil-Av £., Feibush B., Charles-Sigler R., Tetrahedron Letters, 10, 1009 (1966).

48.Gil-Av £., Feibush £., Charles-Sigler R., in «Gas Chromatography», Ed. by A. B. Littlewood, Bartholomew Press, Sixth Intern. Symp., London, 1966,

p.227.

49.Gil-Av £., Nurok D., Proc. Chem. Soc., 1962, 146.

50.Giuffrida £., J. Assoc. Office Agr. Chemists, 47, 293 (1964).

51.Goldberg G., Ross W. A., Chem. Ind. (London), 1962, 657.

52. Graf} J., Wein J. P., Winitz M., Federation Proc., 22, 244 (1963).

53.Gross £>., Grodsky G., J. Am. Chem. Soc., 77, 1678 (1955).

54.Greer M., Williams С. M., Anal. Biochem., 19, 40 (1967).

55.Hagen P., Black 97., Federation Proc., 23, 371 (1964).

56.Hagen P. B., Black 97., Can. J. Biochem., 43, 309 (1965).

57.Halasz /., Bdnnig K-, Z. Anal. Chem., 211, 1 (1965).

58.Halpern B., Wesiley J. 97., Chem. Commun., 12, 246 (1965).

59.Halpern £., Wesiley J. 97., Biochem. Biophys. Res. Commun., 19, 361 (1965).

60. Halpern В., Westley J. W., Tetrahedron Letters, 21, 2283 (1966).

61.Halpern В., Westley J. W., Australian J. Chem., 19, 1533 (1966).

62.Hann C. S., Biochim. Biophys. Acta, 181, 342 (1969).

63.Horning M G., Moss A. M., Horning E. C., Biochem. Biophys. Acta, 148, 597 (1967).

64.Hunter I. R., Dimick К. P., Corse I. W., Chem. Ind. (London), 1956, 294.

65.Hunter I. R., Potter E. F., Anal. Chem., 30, 293 (1958).

66.Ikekawa N., J. Biochem. (Tokyo), 54, 279 (1963).

67.Ikekawa N., Hoshino 0., Watanuki R., Orimo H., Fujita T., Yoshikawa M.,

Anal. Biochem., 17, 16 (1966).

68.Irreverre F., Morlta K-, Ishii S., Witkop B ., Biochem. Biophys. Res. Commun., 9, 69 (1962).

69.Ishii S„ Witkop B . t J. Am. Chem. Soc., 85, 1832 (1963).

70.laakonmaki P. /., Stouffer J. E., J. Gas Chromatog., 5, 303 (1967).

71.James A. T., Martin A. J. P., Analyst, 77, 915 (1952).

72. Johnson D. E., Scott S. J., Meister A., Anal. Chem., 33, 669 (1961).

73.Karagounis G., Lemperle E., Z. Anal. Chem., 189, 131 (1962).

74.Karagounis G., Lippold G., Naturwiss., 46, 145 (1959).

75.Karmen A., Giuffrida L., Nature, 201, 1204 (1964).

76.Каррер П., Курс органической химии, ГНТИ хим. лит., Л. 1960.

77.Klebe J. F., Finkbeiner Н., White D. М., J. Am. Chem. Soc., 88, 3390 (1966).

78.Lamkin W. M., Gehrke C. W., Anal. Chem., 37, 383 (1965).

79. Landowne R. A., Lipsky S. R., Federation Proc., 22, 235 (1963).

80.Landowne R. A., Lipsky S. R., Nature, 199, 141 (1963).

81.Levesque C. L., Craig A. M., Ind. Eng. Chem., 40, 96 (1948).

82.Losse G., Losse A., Stoock J., Z. Naturforsch., 17b, 785 (1962).

83. Makasumi S., Nicholls С. H., Saroff H. A., j. Chromatog., 12, 106 (1963).

84. Makasumi S., Saroff H. A., J. Gas Chromatog., 3, 21 (1965).

85. Marcucci F., Mussini E., Roy F., Gagliardi P., J. Chromatog., 18, 487 (1965).

86.Martin A. J. P., Synge L. M., Biochem. J., 35, 1358 (1941).

87.Mason P. S., Smith E. D., J. Gas Chromatog., 4, 398 (1966).

88.Melamed N , Renard M., J. Chromatog., 4, 339 (1960).

89.Mill P. J., Crimmin W. R. C., Biochim. Biophys. Acta, 23, 432 (1957).

90.Moore S., Stein W. H., J. Biol. Chem., 211, 893 (1954).

91.Moore S., Spackman D. H., Stein W. H., Anal. Chem., 30, 1185 (1958).

92.Mussini E., Marcucci F., J. Chromatog., 20, 266 (1965).

93.Nicholls С. H., Makasumi S., Saroff H. A., J. Chromatog., II, 327 (1963).

94.Pierce A. E., Silylation of Organic Compounds, Pierce Chemical Co., Rock­ ford, Illinois, 1968.

95.Pirkle W. H., J. Am. Chem. Soc., 88, 1837 (1966).

96.Pisano J. J., Vanden Heuval W. J. A., Horning E. C., Biochem. Biophys. Res. Commun., 7, 82 (1962).

97.Pitt-Rivers R., Rail J. E ., Endocrinology, 68, 309 (1961).

98.Pollock G. E., Anal. Chem., 39, 1194 (1967).

99.Pollock G. E., Kawauchi A. H., Anal. Chem., 40, 1356 (1968).

100.Pollock G. E., Oyama V. /., J. Gas Chromatog., 4, 126 (1966).

101.PollockG. E., Oyama V. /., Johnson R. D., J. Gas Chromatog., 3, 174

(1965).

102.Richards A. H., Mason W. B ., Anal. Chem., 38, 1751 (1966).

103.Riihlmann K., J. Prakt. Chem., 9, 86 (1959).

104.Riihlmann K., J. Prakt. Chem., 9, 315 (1959).

105.Riihlmann /С, Chem. Ber., 94, 1876 (1961).

106.Riihlmann /<., Giesecke W., Angew. Chem., 73, 113 (1961).

107.Riihlmann K., Michael G., Bull. Soc. Chim. Biol., 47, 1467 (1965).

153. Gehrke С. W., Nakamoto Н., Zumwalt R. W., J. Chromatog., 45, 24 (1969). 154. Gelpi £., Koenig W. A., Gibert /., Oro /., J. Chromatog. Sci., 7, 604

(1969).

155.Halasz /., Horvath C., Anal. Chem., 36, 2226 (1964).

156.Islam A., Darbre A., J. Chromatog., 43, 11 (1969).

157. Kruppa R. F., Henly R. S., Sinead D. L., Anal. Chem., 39, 851 (1967).

158.Neri P., Tarli P., Quad. Sclavo Diagn., 5, No. 1(1969).

159.Roach D., Gehrke C. W., J. Chromatog., 43, 303 (1969).

160.Roach D., Gehrke C. W., Zumwalt R. W., J. Chromatog., 43, 311 (1969).

161.Roach D., Gehrke C. IF., J. Chromatog., 44, 269 (1969).

162.Stouffer J. E., J. Chromatog. Sci., 7, 124 (1969).

163.Waterfield M. D., Del Favero A., J. Chromatog., 40, 294(1969).

Г Л А В А 3

Газовая хроматография пептидов

Б. Кольб

3.1.ВВЕДЕНИЕ

Свведением газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в каче­ стве метода анализа аминокислот, пептидов и родственных сое­ динений значительно возросли возможности новых достижений в области пептидной химии. Значительные усилия были направ­ лены на развитие аминокислотного анализа методом ГЖХ, для чего исследовались различные типы производных. Однако в ко­ личественном анализе всем ГЖХ методам приходилось конку­ рировать с хорошо разработанными методами ионнообменной хроматографии, отличающимися высокой степенью автоматиза­ ции, точности и даже скорости анализа (например, метод лигандного анализа). По этой причине ГЖХ аминокислот в по­ следние годы нашла практическое применение в большей мере для некоторых специальных задач, где она могла даже превос­ ходить другие хроматографические методы, а не для количест­ венного определения аминокислот в сложных смесях. Однако теперь ГЖХ молено использовать в качестве дополнительного метода и для этой цели благодаря аналитическому подходу, раз­ работанному главным образом Герке и сотр. [1].

По сравнению с другими хроматографическими методами при анализе пептидов ГЖХ обладает рядом преимуществ, ко­ торые связаны с высокой разделяющей способностью и много­ численными возможностями метода, причем оба качества оказы­ ваются ценными и необходимыми, если учесть большое раз­ нообразие соединений в этой области. Одним из основных достоинств ГЖХ является то, что разделение основано на разли­ чиях в коэффициентах активности и давлении паров соответ­ ствующих соединений, т. е. соединения разделяются в соответ­ ствии не только с полярностью, но и температурами кипения. Тем не менее если с помощью ГЖХ (преимущественно с про­ граммированием температуры) анализируется сложная смесь многих соединений с широким диапазоном молекулярных весов, то элюирование происходит главным образом в порядке увели­

чения молекулярного веса. Химические свойства соединений мо­ гут изменять времена удерживания благодаря межмолекуляр­ ному взаимодействию с жидкой фазой лишь до определенного предела. Такую сложную смесь представляет собой, например, частичный гидролизат белка, содержащий соответствующие аминокислоты и полный набор всех возможных пептидов, полу­ чающихся в результате статистического расщепления пептидных связей. При использовании ГЖХ с программированием темпера­ туры можно пройти всю область от низших летучих аминокислот до дипептидов и высших пептидов, причем различные классы соединений элюируются в различных температурных интервалах с малым перекрыванием последних. Этим способом сложную смесь можно грубо разделить на различные классы соединений, начиная с группы аминокислот, за которой следуют дипептиды, смешанные с трипептидами и более длинными пептидами только на границе соответствующей им области. Ясно, что распределе­ ние соединений, осуществляемое ГЖХ на колонке с программи­ рованием температуры, должно обладать преимуществом перед другими хроматографическими методами, в которых соединения разделяются главным образом по химическим свойствам, в ре­ зультате чего на хроматограмме аминокислоты и пептиды на­ ходятся вместе.

На рис. 1 показано разделение синтетической смеси амино­ кислот и дипептидов в виде N-ТФА-метиловых эфиров на стек­ лянной капиллярной колонке с программированием темпера­ туры. При использовании данной колонки, изготовленной для специальных задач, можно видеть две отличающиеся области аминокислот (от аланина до фенилаланина) и дипептидов (от аланилаланина до фенилаланилфенилаланина). Ясно, что эта специфическая смесь содержит не все возможные аминокислоты и дипептиды.

Разделение сильно различающихся по составу соединений с программированием температуры не является единственной воз­ можностью применения ГЖХ — можно также осуществить сложное разделение изомеров, преимущественно в изотермиче­ ских условиях на высокоэффективных капиллярных колонках. На рис. 2 показано разделение на стеклянной капиллярной ко­ лонке с пропиленгликолевой жидкой фазой некоторых родствен­ ных диастереомерных метиловых эфиров N-ТФА-дипептидов, входящих в состав синтетической смеси. В данной смеси пред­ ставлены все возможные комбинации диастереомерных дипепти­ дов, полученных только из двух DL-аминокислот.

Одной из важнейших возможностей применения ГЖХ в ана­ лизе пептидов является ее сочетание с масс-спектрометрией для последующего анализа разделенных пептидов. Такая комбина­ ция ГЖХ и масс-спектрометрии служит мощным средством